哮喘患者记忆CD4T细胞活化相关基因的研究

摘要

[研究背景和目的]免疫系统在再次遇到相同抗原刺激时,能出现迅速而增强的应答,这种现象被称为免疫记忆.哮喘是一种具有多基因遗传倾向的复杂性状疾病,哮喘患者对变应原的反应性比正常人要强得多.对实验性小鼠模型的研究表明,记忆CD4<'+>T细胞在哮喘小鼠的发病机制中发挥了重要的作用.而在人类的哮喘发病机制中,记忆CD4<'+>T细胞起了什么作用,是通过什么途径来发挥作用的,国内外都没有相关的报道.该课题拟通过DDRT-PCR方法筛选哮喘患者和正常人的记忆CD4<'+>T细胞活化后差异表达基因,以期明确记忆CD4<'+>T细胞在哮喘发病机制中的作用.[材料和方法]抽取正常人及缓解期哮喘患者外周血10-20ml,使用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞,然后在细胞悬液中加入一系列的小鼠抗人单克隆抗体(CD11b、CD14、CD16、CD41、CD8、CD19、MHC-Ⅱ、CD45RA),使用藕连有二抗的免疫磁珠去除结合有抗体的细胞,通过流式细胞术鉴定记忆CD4<'+>T细胞的纯度.分离的细胞用完全RPMI1640细胞培养液重悬,加入CD3和CD28单抗联合刺激,37°C培养24小时.细胞总RNA的抽提按照RNA抽提试剂盒的操作步骤进行,DDRT-PCR操作步骤按照BECKMAN公司的荧光DDRT-PCR试剂盒所附的说明书进行.DDRT-PCR显示的差异表达条带经克隆、测序,使用blast软件与GenBank、EMBL、DDBJ、PDB及EST数据库中的序列进行同源性分析,RT-PCR鉴定序列的真实性.[结论]成功建立了一种免疫磁珠负选法分离外周血记忆CD4<'+>T细胞的方法.通过DDRT-PCR方法,成功克隆并鉴定了哮喘患者激活的记忆CD4<'+>T细胞上调表达的两个基因:IL-7和MM-1,这两个上调表达的基因可能参与了哮喘患者的发病机制.

目录

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前言

第一部分 外周血记忆CD4+T细胞的分离纯化及活化、培养

第二部分 DDRT-PCR方法筛选哮喘患者记忆CD4+T细胞活化相关基因

结论

参考文献

致谢

附录

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