利用转基因和基因剔除技术研究KIF18A和Adiponectin基因功能

摘要

本研究通过对PLAGl转基因小鼠转基因插入位点进行鉴定，首次发现转基因插入小鼠2号染色体基因组后，引起KIFl8A基因缺失，发现该基因缺失导致雄性小鼠不育，并对其可能的机制进行了研究；利用同源重组技术构建成功KIFl8A全基因打靶质粒并获得了同源重组ES细胞克隆。　　本研究通过向受精卵导入外源转基因DNA序列后，转基因序列可能随机的插入小鼠基因组的任意位置，其中约5-10％的转基因插入位点位于小鼠的一个内源性基因内，导致这些基因的断裂或缺失而表达丧失或表型异常。这种情况下，转基因作为断裂或缺失基因的分子标记物，为区分突变性表型缺陷和潜在的遗传性缺陷提供了一种直接的方法。所以用转基因插入突变分离有趣表型相关新基因并对其功能进行进一步研究不失为一种有效的方法。　　本研究同时设计构建了KIFl8A全基因剔除打靶质粒，通过ES细胞打靶，获得了两个同源重组ES细胞克隆，期望建立KIFl8A定位剔除基因小鼠模型，对其功能进行更深入研究。　　本论文课题还建立了脂肪特异分泌蛋白Adiponectin基因剔除及LacZ基因敲入动物模型对Adiponectin基因功能进行了研究。

目录

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第一部分：PLAG1转基因定位插入小鼠染色体引起KIF18A基因缺失研究

前言

1材料

2方法

3结果

3.1PLAG1转基因小鼠的获得

3.2PLAG1转基因小鼠系转基因插入位点鉴定和测序分析

2.4KIF18A基因定位缺失

3.3KIF18A缺失小鼠基因型鉴定

3.4小鼠KIF18A基因分析

3.5PLAG1转基因小鼠系统基因插入位点鉴定及插入拷贝数分析

3.6转基因Northern blot表达分析

3.7KIF18A荧光定位分析

3.8小鼠睾丸组织KIF18A不同转录本半定量PCR扩增分析

3.9KIF18A+/+小鼠和KIF18A-/-小鼠主要组织中KIF18A的表达检测

3.9野生型小鼠睾丸组织KIF18A表达与检测

3.10不同周龄小鼠睾丸组织KIF18A四种转录本CDs半定量RT-PCR表达分析

4讨论

第二部分：KIF18A基因缺失引起雄性纯合小鼠不育作用机理初探

前言

1材料

2方法

3结果

3.121系统基因小鼠雄性小鼠不育形态学观察,全身组织病理切片检查

3.2KIF18A雄性小鼠血清激素水平

3.3KIF18A雄性小鼠有丝分裂或减数分裂时相标志分子半定量RT-PCR检测

3.4KIF18A小鼠睾丸切片F-actin、α-tubilin、DIPA三色原位荧光杂交分析

3.5KIF18A小鼠睾丸组织切片Brdu掺入实验

3.6KIF18A小鼠睾丸细胞凋亡分析-Tunel实验

3.7KIF18A雄性小鼠细胞凋亡及细胞周期相关分子半定量RT-PCR检测

3.8初生小鼠睾丸电子显微镜切片分析

3.9KIF18A小鼠全胚碱性磷酸酶染色分析

4讨论

第三部分：KIF18A基因定位敲除小鼠模型的建立

前言

1材料

2方法

3结果

4讨论

第四部分：Adiponectin基因敲除及LacZ基因敲入小鼠模型的建立

前言

1材料

2方法

3结果

4讨论

结论

综述 小鼠雄性不育相关基因研究进展

参考文献

致谢

研究生期间发表和待发表的论文