可逆性永生化正常成人肝细胞rSSR＃69/HL-7702的构建及其生物学特性的测定

摘要

肝功能衰竭的发生率和死亡率甚高，目前缺乏有效的治疗手段。国内外动物实验及初步临床研究证明：采用猪肝细胞或肝癌细胞的生物型人工肝，可以暂时地或部分地替代衰竭肝脏的功能。但动物源性细胞仍存在着免疫反应、人畜共患病及伦理学的担心；而肝癌细胞可能存在功能幼稚及致瘤性的危险。正常人肝细胞应是生物型人工肝最理想的细胞来源。但人胚胎肝细胞功能幼稚并存在伦理学问题；正常成人肝细胞在体外的增殖能力十分有限，难以大规模培养获得足量的肝细胞用于人工肝治疗。尝试建立永生化人肝细胞，有望解决这一难题。 20世纪60年代初从猿猴肾细胞中发现的SV40病毒，具有调节细胞周期调控点、使细胞进入永生化状态的作用，已广泛用于多种哺乳动物细胞的永生化(如骨髓、涎腺、乳腺、前列腺、食管等)。但永生化细胞存在过度增殖致瘤的危险。近来有研究发现在细胞中导入HSV-tk自杀基因，在更昔洛韦的作用下，该细胞内脱氧核糖核酸的合成可中止，避免细胞的致瘤性。有研究发现转导Cre酶的重组腺病毒后，可切除SV40T基因，使细胞产生“去永生化”效应。 本研究拟在正常成人肝细胞HL-7702中导入SV40T永生化基因和HSV-tk自杀基因，以构建可逆性永生化正常成人肝细胞(rSSR＃69/HL-7702肝细胞)。旨在增加肝细胞的增殖活力，以通过体外培养获得大量的肝细胞，并在需要时可诱导其去永生化。 研究采用逆转录病毒载体的方法，将SV40T永生化基因和HSV-tk自杀基因导入正常成人肝细胞HL-7702内；分别采用RT-PCR法、间接免疫荧光法和Western blot法，在基因水平及蛋白水平，鉴定转染后肝细胞内SV40T永生化基因及其表达；采用更昔洛韦药物敏感试验检测转染后肝细胞内HSV-tk自杀基因的存在；采用MTT染色法和流式细胞法，检测转染前后肝细胞的增殖的生长曲线和细胞周期；采用RT-PCR法检测转染后细胞内存在的肝细胞特有的功能基因；采用Western blot法检测肝细胞内细胞色素P450酶蛋白；在相差显微镜下观察细胞的生长形态；用透射电镜观察肝细胞超微结构。 结果：(1)RT-PCR法、间接免疫荧光法和Western blot法显示：所构建的可逆性永生化正常成人肝细胞rSSR＃69/HL-7702内存在SV40T永生化基因并能表达；(2)更昔洛韦药物敏感试验表明：转染后的rSSR＃69/HL-7702肝细胞内存在HSV-tk自杀基因；(3)RT-PCR法检测结果表明转染前后的肝细胞均存在肝细胞特有的功能基因，如白蛋白、糖原合成基因等；(4)生长曲线和细胞周期测定结果显示转染后的rSSR＃69/HL-7702肝细胞的增殖活力高于未转染的肝细胞；(5)光镜下和电镜下转染前、后肝细胞的形态和超微结构无明显差异；(6)肝细胞培养上清液的测定表明转染前、后肝细胞的一般生化功能和利多卡因转化功能无明显差异；(7)Western blot法检测结果显示：转染前、后的肝细胞均可表达细胞色素P450酶蛋白；(8)转染前、后的肝细胞培养上清液中未检测出甲胎蛋白。 本研究构建了含有SV40T永生化基因和HSV-tk自杀基因的可逆性永生化正常成人肝细胞rSSR＃69/HL-7702；该细胞增殖能力提高；其形态及生物学功能与转染前的正常人肝细胞HL-7702无明显差异；并且未检出幼稚肝细胞分泌的甲胎蛋白。提示该细胞有望解决人肝细胞来源稀少的难题，为生物型人工肝治疗肝衰提供更加理想的人肝细胞源，值得进一步研究。

目录

论文说明：英文缩略语

声明

前言

第一部分可逆性永生化正常成人肝细胞rSSR#69/HL-7702的构建

第一节含SV40大T抗原永生化基因和HSV-TK自杀基因的逆转录病毒SSR#69的包装

材料和方法

结果

第二节逆转录病毒SSR#69对正常成人肝细胞HL-7702的转化

材料与方法

结果

第二部分可逆性永生化正常成人肝细胞rSSR#69/HL-7702的生物学特性测定

第一节可逆性永生化正常成人肝细胞rSSR#69/HL-7702的形态学观察

材料与方法

结果

第二节可逆性永生化正常成人肝细胞rSSR#69/HL-7702的生长特性

材料与方法

结果

第四节可逆性永生化正常成人肝细胞rSSR#69/HL-7702药物代谢功能的测定

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 生物型人工肝的细胞选择的进展

攻读学位期间发表文章情况

致谢