人工合成酿酒酵母7号染色体

摘要

2011年，由纽约大学 Jef Boeke教授牵头设立了“Synthetic Yeast Genome Project”计划（SC2.0），该计划集合美国、英国、中国、中国香港、印度等地区的多个高校及科研院所共同完成酿酒酵母16条染色体和1条单独的tRNA染色体的人工全合成。
　　目前为止，约翰霍普金斯大学（JHU）负责的chr09R、chr06L和chr03染色体已经合成完毕，其成果分别发表在《Nature》和《Science》杂志。chr06、chr12、chr05合成工作已接近尾声。华大基因承担chr02，chr07和chr13三条染色体的合成，其中的chr02正在开展酵母体内后续验证实验。
　　本课题synchr07合成项目属于“人工合成酿酒酵母染色体”项目的扩展课题。由华大基因和爱丁堡大学（UOE）合作完成，其中chr07L由华大负责合成，chr07R由爱丁堡大学负责合成。chr02染色体合成项目的前期工作中，较好解决了酵母人工染色体合成涉及的DNA组装、替换等相关基本技术难题。但在组装效率、精确性等方面的进一步提升方面仍有较大优化空间。同时，针对SCRaMbLE诱导染色体重排后的研究，包括基因群功能、新表型研究方面仍需摸索。
　　本研究在野生型7号染色体基础上，设计了1015 kp长度的合成染色体。利用SegMan软件将合成型7号染色体逐级切分成不同长度的DNA片段，切分好的DNA片段按照长度由小到大分类，分别是长度为2-3 Kb级别的minichunk片段，长度在10 Kb左右的chunk片段，以及长度在50 Kb左右的megachunk片段。在体外用Gibson组装方法将minichunk拼接成chunk片段，电泳鉴定与测序结果都显示出7号染色体左臂42个chunk片段全部组装成功。得到的chunk片段通过彼此间长约1 kb的同源臂，在酵母体内进行双向同源重组替换。7号染色体左臂总共要进行14轮替换，从megachunk A替换至megachunk N，目前已完成前12轮替换，得到替换菌株SynA-L，PCR Taq鉴定结果表明该替换菌株A-L段已成功替换成合成型序列，但PGM测序结果显示替换菌株的A3-B5段有一个串联拷贝变异。随后，我们将进一步完成剩余片段的替换，并修复其中的变异。
　　chr07具有明显的特征，如maltose代谢基因的富集，tRNA数量最多等。本研究对该染色体的合成及后续工作，对于基因功能，基因组结构变异和物种进化方面的研究是一个很好的切入点。

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主要符号表

第一章 绪 论

1.1 选题背景

1.2 主要基因组设计、精简研究简介

1.3 酵母基因组人工合成简述

1.4 立意依据及意义

1.5 研究内容及技术路线

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验试剂

2.3 实验仪器

2.4 实验方法

第三章 结果与分析

3.1Gibson组装实验结果

3.2 染色体替换实验结果

3.3 CRISPR-cas9诱导替换系统构建实验结果

第四章 讨论

4.1 酵母染色体合成DNA组装方案的比较

4.2 酵母染色体替换整合方案的比较

4.3 7号染色体合成结构变异修复方案

第五章 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间取得的成果