抑制GSK3β增强裸鼠皮下人脑胶质母细胞瘤放射敏感性的研究

摘要

胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）发生于中枢神经系统，有着生存率低、恶性程度高、复发率高、侵袭性高的特点。由于GBM呈浸润性生长，手术难以完全切除，目前在临床上最有效的治疗方法是手术切除肿瘤并联合放疗。然而由于放疗抵抗的存在，大多数患者的肿瘤仍然会复发。GBM 的放疗抵抗与DNA双链断裂（DNA double strand breaks，DSBs）修复激活有着十分密切的关系。我们在前期研究中发现，糖原合成酶激酶3β（Glycogen synthase kinase 3β, GSK3β）可在电离辐射的作用下由胞浆转移至胞核，结合p53结合蛋白1(p53 binding protein, 53BP1)并诱导其磷酸化，继而促进U87细胞DSBs修复过程，增加肿瘤的放疗抗性，使细胞凋亡减少且细胞增值率增加。由于前期实验都是体外细胞实验，因此需要通过构建荷瘤鼠模型进一步研究特异性化学抑制GSK3β的表达可否体内消除GSK3β的核易位，并抑制GSK3β参与53BP1介导的DSBs修复，从组织和动物水平来评估GSK3β作为靶点的放疗增敏剂开发的科学依据。 研究方法为接种 U87细胞悬液于裸鼠皮下，建立荷瘤鼠摸型，并将其随机分为4组：1）对照组：荷瘤鼠模型建立成功后，不给于任何治疗；2）IR组：荷瘤鼠模型建立成功后，给予25Gy电离辐射处理；3）SB216763组：荷瘤鼠模型建立成功后，给予腹腔注射5mg/kg SB216763；4）SB216763+IR组：荷瘤鼠模型建立成功后，先给予腹腔注射5mg/kg SB216763，再给予25Gy电离辐射处理。观察并记录20天内各组荷瘤鼠体内肿瘤的体积变化、体重变化和100天内荷瘤鼠的生存曲线，并将荷瘤鼠皮下肿瘤剥离、称重并固定以进行TUNEL原位染色。 研究结果表明SB216763+IR处理组与IR处理组、SB216763处理组和对照组相比肿瘤体积与肿瘤重量显著减少（ n=10, P<0.05 by ANOVA with Bonferroni post-hoc test），小鼠体重恢复明显(n=10, P<0.05 by ANOVA with Bonferroni post-hoc test)；从生存曲线判断，SB216763+ IR 处理组与其它组相比荷瘤鼠的生存时间显著延长(n=10, P<0.05 by Kaplan-Meier)。此外，TUNEL标记处理的SB216763+ IR组肿瘤组织中可观察到更多的U87凋亡细胞。 因此基于上述定性和定量分析的结果，表明GSK3β抑制剂SB216763能增加胶质母细胞瘤的体内放射敏感性。

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第一章 绪 论

1.1 研究工作的背景与意义

1.2 国内外研究现状

1.2.1 GBM治疗策略研究现状

1.2.2 GSK3与肿瘤的国内外研究历史与现状

1.3 本文的主要贡献与创新

1.4 本论文的结构安排

第二章 实验材料及方法

2.1 试剂

2.2 仪器设备

2.3 实验动物与细胞株

2.4 主要试剂的配制

2.4.1 DMEM完全培养基的配制

2.4.2 细胞冻存液的配制

2.4.3 PBS缓冲液配制

2.4.5 10%中性福尔马林固定液

2.4.6 乙醇梯度溶液的配制

2.4.7 PROTEINASE K 工作液的配制

2.5 实验方法

2.5.1 U87细胞培养

2.5.2 荷瘤鼠模型的建立

2.5.3 实验动物分组

2.5.4 实验动物处置

2.5.5 肿瘤体积与重量观察

2.5.6 TUNEL原位染色观察荷瘤鼠体内U87细胞凋亡

2.5.7 荷瘤鼠体重与生存曲线观察

2.5.8 统计方法

第三章 实验结果

3.1 荷瘤鼠成瘤性结果

3.2 各组荷瘤鼠肿瘤体积比较

3.3 各组荷瘤鼠肿瘤重量比较

3.4 各组肿瘤直径比较

3.5 TUNEL染色结果

3.5.1 对照组的TUNEL染色结果

3.5.2 SB216763+IR组的TUNEL染色结果

3.6 各组荷瘤鼠体重比较

3.7.1 对照组生存时间

3.7.2 IR组生存时间

3.7.3 SB216763组生存时间

3.7.4 SB216763 +IR组生存时间

3.7.5 各组荷瘤鼠生存曲线

3.8 本章小结

第四章 讨论

4.1 实验方法的讨论

4.1.1 辐射方式与射线剂量的确定

4.1.2 SB216763抑制剂的选择

4.1.3 裸小鼠异位移植瘤模型的建立

4.1.4 裸小鼠治疗时间的选择

4.1.5 细胞凋亡检测：TUNEL和DAPI染色

4.1.6 生存分析

4.2 实验结果的讨论

第五章 全文总结及展望

5.1 全文总结

5.2 后续工作展望

综述

致 谢

参考文献