基于自适应光学的双光子显微成像系统研究

摘要

双光子荧光显微成像技术是开展微观生命科学研究的重要手段和工具，使用该技术既可以观察生物体内的精细结构，也能够动态追踪生物体内组织、细胞、细胞核、蛋白、小分子等不同尺度的生命活动过程，研究深层组织的高空间分辨率荧光显微成像技术，是当前显微成像领域的一个前沿课题。由于生物组织通常具有非透明非均匀的结构，激发光和发射荧光在生物组织内传播时均会由于折射、散射、吸收等作用使得光束波前发生明显畸变，使得成像质量较差。借助自适应光学技术（Adaptive optics，AO）可对经由生物组织传播产生的波前畸变进行实时探测和精确校正，从而提升荧光成像的空间分辨率和深度。本文主要围绕基于自适应光学的双光子显微成像系统展开研究，主要研究内容如下： 1，对双光子显微成像理论进行了分析，详细讨论了双光子显微成像的物理机制、双光子显微成像系统的组成、成像特点以及系统优化的基本方法，为后续光路的设计提供理论依据。另外，通过对成像特点的分析，利用 AO 技术进行像差校正，可提高双光子显微成像的分辨率。 2，对自适应光学原理进行了分析，推导出了前十五个泽尼克（Zernike）多项式，并给出在光波波前误差中的含义，利用 Matlab 软件对前十个 Zernike 多项式定义的波前进行仿真，分析了波前峰谷值（Peak to valley，PV）和均方根（Root mean square，RMS），采用RMS表征了波前像差，RMS越小，自适应闭环效果越好。 3，基于显微成像的理论分析，设计了一套基于自适应光学的双光子显微成像系统。利用Zemax软件对成像系统的照明光路进行仿真，并采用点列图分析方法对光路进行分析，结果表明在整个扫描视场内，均能达到衍射极限。优化了荧光探测光路，可有效提高荧光的收集效率。 4，搭建了一套基于AO的双光子显微成像系统，从红光准直光源、哈特曼标定、照明光路、显微物镜调节以及探测光路五个方面优化了显微成像系统的结构和性能，并验证了整个系统的自适应闭环效果。最后，对老鼠肾脏切片荧光标本进行显微成像，验证了该显微成像系统的有效性。

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