基于组织工程预血管化对同种及异种胰岛移植的可行性研究

摘要

目的：临床上90%的胰岛移植是经门静脉肝内移植,然而移植在肝内的胰岛由于局部缺氧、炎症而发生凋亡最终导致移植失败.本课题主要通过在小鼠皮下腹股沟处建立组织工程预血管化小室并探索同种胰岛移植及异种胰岛移植的可行性研究,为体内预先构建预血管化小室作为胰岛移植部位提供理论依据. 方法:将5mm长硅胶管包绕腹股沟处腹壁血管,硅胶管内注入微血管生长所需的MatrigelTM基底膜和生长因子(bFGF-2)构建组织工程小室.分别在7d、14d、28d、35d和42d取组织工程小室内新生组织,通过HE染色和免疫组化标记anti-CD31和anti-VEGF分析组织工程小室内微血管生长情况.链尿佐菌素诱导1型糖尿病模型,分离胰岛并移植到预血管化组织工程小室内,记录移植后糖尿病小鼠的体重及血糖变化.其中同种异基因移植组及异种移植组接受小剂量anti-CD45RB和/或anti-CD40L抗体治疗,比较在不同的抗体治疗方案下,移植物存活情况.异种移植两周后,免疫组化标记anti-CD4、anti-CD8观察移植前期胰岛浸润程度.长期存活移植物免疫组化标记anti-insulin观察组织工程小室内胰岛细胞形态;最后,通过急性腹腔内葡萄糖刺激实验探讨糖负荷后组织工程小室内胰岛功能. 结果:通过HE染色及免疫组化结果观察发现,预血管化时间与组织工程小室内微血管量成正比,其中预血管化28d、35d及42d后小室内已形成丰富的微血管网络化.通过Real-time PCR定量分析表明,预血管化28d与35d和42d组的血管内皮生长因子基因表达量差异没有统计学意义(P＞0.05).据此,我们拟将预血管化28d作为下一步胰岛移植的最优时间.在同种同基因胰岛移植组(n=6)中移植物未发生排斥反应并长期存活.在同种异基因移植组中,单用anti-CD45RB或anti-CD40L治疗后,移植物均很快被排斥;但联合双抗治疗后所有移植物都可长期存活.在异种移植组中,单用anti-CD45RB或anti-CD40L治疗均不能诱导移植物长期存活.但联合双抗治疗后,16/20只糖尿病小鼠血糖恢复正常且未发生排斥反应;出现排斥的4只糖尿病小鼠进行了二次移植,其中3只血糖恢复正常且未发生排斥反应;通过免疫组化分析异种移植两周后的胰岛发现,双抗治疗后胰岛未被效应T细胞浸润.观察长期存活移植物免疫组化标记anti-insulin发现,胰岛素分布于细胞团内,胰岛形态完整.腹腔下急性葡萄糖刺激实验结果表明,在糖负荷下,移植组小鼠释放胰岛素能力与正常组小鼠相比没有明显差异,120min后血糖均恢复正常. 综上所述,组织工程预血管化对同种及异种胰岛移植有着重要的促进意义,腹股沟下包埋组织工程小室有望成为胰岛移植的部位之一.此研究为将来辅助性生物材料应用于临床胰岛移植提供理论基础.

目录

声明

缩略词表

第一章 绪 论

1.1 糖尿病的发病机制及现状

1.2.1 传统治疗手段

1.2.2 胰岛移植治疗1型糖尿病的研究进展

1.3.1 生物学因素

1.3.2 肝内胰岛移植

1.3.3 肝外胰岛移植

1.3.4 胰岛与辅助化装置联合移植

1.4 本文的主要贡献与创新

1.5 本论文的结构安排

第二章 小鼠腹股沟处建立组织工程预血管化小室

2.1 实验动物与饲养

2.2.1 实验仪器

2.2.2 试剂与材料

2.2.3 其他相关材料

2.2.4 主要试剂配制

2.3.1 小鼠组织工程小室构建方法

2.3.2 组织工程预血管化小室内新生组织HE染色

2.3.3 免疫组化检测组织工程小室内微血管网络化形态学鉴定

2.3.4 实时定量PCR分析组织工程预血管网络化程度

2.4 统计学方法

2.5 结果

2.5.1 构建小鼠组织工程预血管化小室及微血管形态学观察

2.6 讨论

2.7 本章小结

第三章 胰岛分离纯化及鉴定

3.1 实验动物

3.2.1 实验仪器

3.2.2 试剂与材料

3.2.3 其他相关材料

3.2.4 主要试剂配制

3.3.1 Balb/c小鼠胰岛细胞分离及鉴定

3.3.2 C57小鼠胰岛细胞分离及鉴定

3.3.3 大鼠胰岛细胞分离

3.3.4 酶联免疫吸附实验ELISA鉴定胰岛细胞活性

3.4 统计学方法

3.5.1 胰岛细胞分离及鉴定

3.5.2 胰岛细胞活性鉴定

3.6 讨论

3.7 本章小结

第四章 预血管化小室作为胰岛移植位点的可行性研究

4.1 实验动物

4.2 实验材料

4.2.1 试剂与材料

4.2.2 其他相关材料

4.3 主要试剂配制

4.4.1 糖尿病模型的建立

4.4.2 实验分组

4.4.3 免疫抑制剂使用方法

4.4.4 移植胰岛细胞

4.4.5 免疫组化分析胰岛细胞浸润程度

4.4.6 腹腔葡萄糖耐量实验

4.5 统计学方法

4.6.1 小鼠糖尿病模型建立

4.6.2 组织工程小室作为胰岛移植的创新性位点

4.6.3 腹腔葡萄糖耐量结果

4.7 讨论

4.8 本章小结

第五章 全文总结与展望

5.1 本文主要贡献

5.2 展望

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间取得的成果