Lgr5对胃癌的恶性生物学行为和化疗耐药性的影响及机制研究

摘要

背景：
　　胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,每年大约有100万新发病例。胃癌在癌症相关性死亡中排在第二位。近年来,尽管胃癌的诊疗技术不断提高,由于胃癌的侵袭和转移,导致其5年生存率仍然低于30％。大量的研究认为肿瘤的侵袭和转移高度依赖于肿瘤细胞的增殖和血管生成,抗血管生成治疗可以使胃癌患者生存获益。此外,在治疗进展期胃癌过程中,术前化疗被广泛应用,因为这种方法可以缩小肿瘤,降低肿瘤的分期,提高肿瘤的切除率,从而改善患者预后。然而,由于化疗耐药性的存在,仅有20%的胃癌患者能够完全或部分缓解。因此,为了提高胃癌的治疗效果,需要寻找与胃癌的侵袭、转移、血管生成和化疗耐药性相关的特异分子并深入研究其调节机制。
　　目的：
　　研究Lgr5在胃癌中的表达情况,分析其与胃癌的侵袭、转移、血管生成、化疗耐药性及预后的关系,并进一步探讨具体作用机制。此外,我们还对接受术前化疗的胃癌患者进行研究,探讨Lgr5在评价化疗效果及判断预后方面的价值。
　　方法：
　　1.收集318例经根治性手术治疗的胃癌患者,进行随访。利用免疫组织化学染色检测Lgr5、MMP2、EphA3、VEGF和CD34在318例胃癌和80例正常胃黏膜组织中的表达。CD34免疫染色用来计数微血管密度(MVD)。通过Westernblot方法检测了75例胃癌新鲜组织标本及相对应的癌旁正常组织中Lgr5,MMP2,EphA3和VEGF蛋白表达情况。并对Lgr5与临床病理学特征之间的关系进行了综合分析。
　　2.应用qRT-PCR和Westernblot技术筛选Lgr5高表达的胃癌细胞株。通过RNA干扰技术敲低胃癌细胞中Lgr5的表达。通过qRT-PCR和Westernblot技术分析沉默Lgr5对MMP2,EphA3和VEGFmRNA和蛋白表达的影响。通过MTT实验检测沉默Lgr5基因对胃癌细胞增殖能力的影响。采用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测沉默Lgr5对胃癌细胞凋亡的影响。采用Transwell和细胞划痕修复实验观察Lgr5siRNA对胃癌细胞侵袭和迁移能力的影响。利用MTT法和二维凝胶血管生成体外模型探讨Lgr5沉默后的胃癌细胞培养上清液对人脐静脉血管内皮细胞(humanumbulicalveinendotheliacell,HUVEC)增殖和管状结构形成的影响。
　　3.采用MTT法和AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞技术检测Lgr5siRNA对接受奥沙利铂和5-FU作用的胃癌细胞的存活率和凋亡率。收集68例接受新辅助化疗的胃癌患者石蜡标本。通过免疫组织化学染色方法检测胃癌组织中Lgr5表达情况,并分析其表达与该类患者的临床病理学特征之间的关系。
　　结果：
　　1.免疫组化染色结果显示:Lgr5在胃癌组织中的阳性表达率明显高于正常粘膜组织(P=0.001)。Lgr5阳性率随着侵润深度增加(T分期)而增高(P=0.001),并且与区域淋巴结转移(P=0.001)和远处转移(P=0.001)相关。多因素生存分析显示Lgr5是影响胃癌患者预后的独立因子(P=0.001)。通过Spearman等级相关检验显示Lgr5表达与MMP2、EphA3、VEGF和MVD呈正相关(P=0.001)。对Westernblot检测结果行Pearson相关检验也进一步验证这一相关性((Lgr5vsMMP2:P=0.001,r=0.875;Lgr5vsEphA3:P=0.001,r=0.474;Lgr5vsVEGF:P=0.001,r=0.921).
　　2.Lgr5在胃癌细胞系AGS中表达量最高。沉默AGS细胞中Lgr5基因可以导致MMP2、EphA3和VEGF表达明显下降(P=0.001)。同时我们还发现沉默Lgr5以后,AGS细胞的增殖、迁徙和迁移能力显著降低(P=0.001),凋亡率显著增高(P=0.001)。Lgr5沉默的胃癌AGS细胞培养液可以抑制HUVEC细胞增殖能力。此外,当利用Lgr5沉默的AGS细胞上清液培养HUVEC时,管状结构形成(2.51±0.19mm/mm2)相比空白对照组(7.34±0.30mm/mm2)和阴性对照组(7.18±0.33mm/mm2)明显减少,差异具有显著性(P=0.001,P=0.001)。
　　3.在化疗药物奥沙利铂和5-FU作用下,Lgr5基因沉默的AGS细胞的存活率较空白对照组和阴性对照组明显下降(P=0.001),凋亡率较空白对照组和阴性对照组显著增加(P=0.001)。肿瘤消退情况差的胃癌中Lgr5阳性表达率显著高于肿瘤消退情况好的胃癌(P=0.001)。将化疗前后两组Lgr5表达情况进行配对分析,发现化疗前Lgr5表达较化疗后低(P=0.001)。多因素分析结果显示Lgr5与接受术前化疗的胃癌患者预后相关,可以作为判断预后的独立因子(P=0.039)。
　　结论：
　　1.Lgr5与胃癌的发生发展有关,可以作为判断胃癌侵袭、转移、血管生成情况以及患者预后的参考指标。
　　2.沉默Lgr5基因可以有效地抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和转移等恶性生物学行为。Lgr5沉默后胃癌AGS细胞培养液可以抑制HUVEC细胞增殖和管状结构形成能力。Lgr5siRNA可以有效抑制β-catenin蛋白、MMP2、EphA3、VEGFmRNA和蛋白的表达。这表明胃癌中Lgr5的表达可以通过激活经典Wnt/β-catenin信号通路,从而促进MMP2、EphA3和VEGFmRNA的转录
　　3.Lgr5可以作为预测化疗疗效的有效指标,同时也可以作为独立影响因子来判断接受术前化疗胃癌患者的预后。沉默Lgr5基因以后可以显著降低AGS细胞的化疗耐药性。
　　4.Lgr5在胃癌的侵袭、转移和血管生成过程中扮演了重要角色,因此,它可以作为有用的治疗靶点。应用RNA干扰技术沉默Lgr5可以成为一种潜在的胃癌基因治疗的手段。

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缩 略 词 表

中文摘要

英文摘要

前 言

参考文献

第一部分 Lgr5在胃癌组织中的表达及临床意义

一、引 言

二、材料和方法

三、结 果

四、讨 论

五、小 结

参考文献

第二部分 Lgr5-siRNA对胃癌侵袭转移影响的实验研究

一、引 言

二、材料和方法

三、结 果

四、讨 论

五、小 结

参考文献

第三部分 Lgr5-siRNA对胃癌及HUVECs血管生成的影响的实验研究

一、引 言

二、材料和方法

三、结 果

四、讨 论

五、小 结

参考文献

第四部分 Lgr5与胃癌化疗耐药关系的研究

一、引 言

二、材料和方法

三、结 果

四、讨 论

五、 小 结

参考文献

全文结论

文献综述

攻读博士期间发表论文情况

附 录

致 谢