补阳还五汤大鼠含药血清对肺成纤维细胞TGF-β1/Smad/ERK信号通路调控研究

摘要

目的：考察补阳还五汤含药血清对肺纤维化大鼠成纤维细胞模型TGF-βl、TGF-βlmRNA、Smad3、Smad4、Smad7、ERK1/2、p-ERK表达的影响，初步探讨具有“益气活血”功效的补阳还五汤抗肺纤维化的分子机制，拓宽补阳还五汤的临床应用空间。
　　方法：⑴采用一次性气管滴入博莱霉素的经典造模方法制备肺纤维化大鼠模型，第14天处死动物，肉眼观察肺组织外观形态改变，制备病理切片，采用苏木素-伊红染色法(haematoxylin-eosine，HE)、Masson三色染色，光镜下观察肺组织病理学改变；⑵采用组织块法对肺纤维化大鼠成纤维细胞进行原代分离培养。用0.25％胰蛋白酶消化，按1：2传代培养。第4代用于实验；⑶采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测上清中TGF-βl的表达；⑷采用实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）检测细胞中的TGF-βl蛋白基因的表达；5.采用Western blot检测细胞中Smad3、Smad4、Smad7蛋白及ERK1/2、p-ERK的表达。
　　结果：①肉眼观察可见双肺呈暗红色，光泽度差，肺组织表面粗糙不平，可见散在出血点和瘀斑；HE染色结果提示，肺泡壁增厚，肺泡间隔明显增宽，肺泡腔内仅见少量炎症细胞浸润，成纤维细胞明显增多；Masson染色结果显示各级支气管及血管外壁、增厚的肺泡隔内均可见蓝色胶原纤维沉积，提示此时ECM增多，促进大量纤维增生；②肺组织块贴壁72 h后，镜下可见成纤维细胞生长，将组织块去除，第7d左右梭形细胞在局部融合成片，20d左右细胞接近完全融合，传代后第2代细胞7d左右接近完全融合，第3代以后融合时间为5d。成纤维细胞为长梭形形态，常呈漩涡状生长；③ELISA检测上清中TGF-βl的表达，结果显示，与模型组比较，阳性组和20%含药血清组，10%含药血清组肺纤维化大鼠成纤维细胞中TGF-β1的表达均有显著减少（P<0.01），5%含药血清组细胞中TGF-β1的表达有减少趋势，三组不同浓度的补阳还五汤含药血清作用效果表现出一定的量效关系；④REAL-TIME PCR检测细胞中的 TGF-βl蛋白基因的表达，结果显示，与模型组比较，阳性组和20%含药血清组肺纤维化大鼠成纤维细胞中TGF-β1mRNA的表达均有显著减少（P<0.01）；10%含药血清组肺纤维化大鼠成纤维细胞中TGF-β1mRNA的表达减少（P<0.05），5%含药血清组细胞中TGF-β1mRNA的表达有减少趋势，三组不同浓度的补阳还五汤含药血清作用效果表现出一定的量效关系；⑤Western blot检测细胞中Smad3、Smad4、Smad7蛋白及ERK1/2、p-ERK的表达，结果显示，与模型组比较，20%补阳还五汤含药血清组肺纤维化大鼠成纤维细胞中Smad3蛋白的表达显著减少（P<0.05），阳性组，10%和5%补阳还五汤含药血清组成纤维细胞中Smad3蛋白表达有减少趋势；阳性组和不同浓度补阳还五汤含药血清组肺成纤维细胞中Smad4蛋白表达有减少趋势；20%含药血清组纤维化肺细胞中Smad7蛋白有显著减少（P<0.05），阳性组和10%和5%含药血清组纤维化肺细胞中Smad7蛋白表达有减少趋势；20%补阳还五汤含药血清组肺成纤维细胞中ERK1/2蛋白有显著减少（P<0.05），阳性组，10%和5%补阳还五汤含药血清组肺成纤维细胞中ERK1/2蛋白表达有减少趋势；阳性组和不同浓度补阳还五汤含药血清组肺成纤维细胞中p-ERK蛋白有均减少趋势。
　　结论：⑴采用一次性气管内滴注博莱霉素的方法诱导大鼠肺纤维化模型造模成功。⑵采用组织块培养法对肺纤维化大鼠成纤维细胞分离及培养成功。⑶采用每天1次，连续给药7d，采血前禁食12h，于末次灌胃1h后采血的给药及取血方案制备补阳还五汤含药血清，其中20%补阳还五汤含药血清组在抑制肺纤维化，调控TGF-β1/Smad/ERK信号通路中的关键细胞因子方面，明显优于其他浓度组，提示该血药浓度可能是适宜的血药浓度。⑷补阳还五汤含药血清能够有效抑制TGF-βl及TGF-βl基因的表达，并能抑制TGF-β1/Smad/ERK信号转导通路中Smad3、ERK1/2等蛋白的过度表达，提示补阳还五汤含药血清能够阻止TGF-β1/Smad/ERK信号转导通路中的关键细胞因子的信号传递，从而发挥较好的抗肺纤维化作用。

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引言

第一部分 前言

1 TGF-β1介导的Smad/ERK信号通路与肺纤维化的关系

2祖国医学对肺纤维化的研究概况

3本论文研究思路

4研究指标选择的意义

5实验技术路线图

第二部分 实验研究

1实验材料

2检测指标及方法

3统计学方法

4实验方法及实验结果

5讨论

6小结

第三部分 结论

第四部分 问题与展望

1 本研究的创新点

2问题及展望

致谢

参考文献

附件一：综述:补阳还五汤研究进展

附件二：附图及附表

附件三：在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果

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