藏药“佐太”中重金属汞的蓄积性及长期使用致潜在肾损伤的机制研究

摘要

目的
　　本研究以藏药“佐太”为研究对象，对其长期用药后药物中重金属汞在血液和肾脏中的蓄积行为及其对肾脏的潜在肾毒性作用进行初步研究，以期揭示藏药“佐太”可能存在的潜在肾毒性及其作用机制，为藏药“佐太”的安全性机制研究提供前期基础，为临床安全合理有效地使用“佐太”提供一定的理论依据。
　　方法
　　（1）通过最大给药量法分别进行KM小鼠和SD大鼠的急性毒性试验，初步探讨藏药“佐太”的安全性；
　　（2）采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS），分别检测给药后90天、135天、180天及停药30天和120天后大鼠血液及肾脏中汞（Hg）的含量，考察Hg在动物血液中的动态变化规律及其在肾脏中的蓄积行为；
　　（3）通过酶联免疫分析法（ELISA），分别测定给药后90天、135天、180天及停药后30天大鼠血液中血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN），尿液中肾损伤因子-1（Kim-1）、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）、视黄醇蛋白（RBP）、β2-微球蛋白（β2-MG），及肾组织中肾损伤因子-1（Kim-1）、金属硫蛋白（MT）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）的含量或活性，此外，对停药120天后大鼠肾组织中GSH含量进行再次检测，探讨藏药“佐太”长期用药过程中蓄积在动物体内的Hg对动物血液、尿液及肾脏中与肾损伤相关的蛋白或酶水平的影响；
　　（4）采用实时荧光定量法（QRT-PCR），考察给药后180天、停药30天后，“佐太”对大鼠肾脏中Kim-1、金属硫蛋白-1（MT-1）、金属硫蛋白-2（MT-2）、谷胱甘肽巯基转移酶（GST-pi）及停药120天后大鼠肾脏中GST-pi的mRNA相对表达量的影响；
　　（5）通过HE染色法、免疫组化法、流式细胞仪（Flow Cytometer，FCM）等方法对给药90天、135天、180天后及停药30后天大鼠肾脏系数、肾组织病理、肾Ki67蛋白表达，肾细胞周期及凋亡率进行检测，考察藏药“佐太”对肾组织细胞形态学、细胞增殖活性、细胞周期及凋亡率的影响。
　　结果
　　（1）藏药“佐太”最大浓度、最大容积分别给KM小鼠和SD大鼠1日内一次性给药3g/kg(相当于成人临床每日推荐剂量0.667mg/kg的4498倍)，连续观察14天，动物外观体征、一般活动正常，饲料消耗量正常，体质量逐步增长，无明显急性毒性反应，初步表明本品属无明显急性毒性药物；
　　（2）藏药“佐太”连续给药180天后，随着给药时间的延长，血汞和肾汞含量均会随之增加，并存在剂量依赖性；大鼠血中的汞较肾脏中的汞代谢快，停药后能基本恢复，而肾脏中的汞虽然呈大幅度下降，但仍有较大的残留蓄积，初步证实“佐太”中汞的主要靶器官是肾脏；
　　（3）藏药“佐太”在连续给药180天及停药30天后，对各组大鼠血清中Scr和BUN，尿液中Kim-1、NAG、RBP、β2-MG，肾组织MDA、SOD没有明显影响，但在给药90天和180天分别造成肾脏中Kim-1、MT、GSH-Px和GSH水平的变化，停药30天后，除GSH活性仍偏高外，其余指标均可逆性恢复，继续停药至停药120天后，GSH活性也恢复到正常水平。
　　（4）藏药“佐太”连续给药180天后，各给药组MT-1 mRNA相对表达量均显著增加，中、低剂量组Kim-1、GST-Pi mRNA相对表达量明显升高，而中、低剂量组MT-2 mRNA相对表达量表现为减少。停药30天后，Kim-1、MT-1、MT-2 mRNA相对表达量已恢复至与空白对照组比较无明显差异，而GST-Pi mRNA相对表达量仍然偏高，推测这是机体的解毒系统对外源性物质刺激所产生的一种应激解毒表现，继续停药至120天后，GST-Pi mRNA相对表达量基本恢复，其中低剂量组较给药期间的值出现了明显回调，这可能与机体的多向调控机制有关，其具体机制有待进一步研究；
　　（5）藏药“佐太”在连续给药180天及停药30天后，各组大鼠肾脏系数、肾组织病理、肾Ki67蛋白表达，肾细胞周期及凋亡率基本没有明显变化，初步表明“佐太”对大鼠肾组织细胞形态学、细胞增殖活性、细胞周期及凋亡率的没有明显影响。
　　结论
　　（1）藏药“佐太”为无明显急性毒性的药物；
　　（2）长期给予藏药“佐太”，可引起大鼠血汞含量升高，并可造成汞在肾脏中大量蓄积，长期停药仍有残留，推测其在肾脏中为永久性的不可逆蓄积；
　　（3）“佐太”长期大量使用可能引起肾脏潜在的可逆性损伤，该作用机制可能与通过影响Kim-1、MT、GSH、GSH-Px的含量或活性及Kim-1、MT、GST-Pi mRNA相对表达水平来激活机体的解毒系统作出应激解毒反应密切相关；
　　（4）临床上使用“佐太”，不仅要对其使用时间和剂量进行控制外，还需对患者血汞及肾功能相关指标进行跟踪监测，残留在肾脏中的汞是否对机体会有进一步损伤，这仍有待于进一步深入研究。

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英文缩略词表

前言

1 藏药“佐太”的研究概况

2无机汞致肾损伤相关研究

3研究思路

第一部分 藏药“佐太”的急性毒性试验研究

1.1材料

1.2方法

1.3统计学处理

1.4结果

1.5小结

第二部分 藏药“佐太”长期毒性实验中大鼠血汞动态变化规律及肾汞蓄积性研究

2.1材料

2.2方法

2.3统计学处理

2.4结果

2.5小结

2.6讨论

第三部分 长期使用“佐太”对大鼠尿液、血液及肾脏中相关蛋白和酶水平的影响研究

3.1材料

3.2方法

3.3统计学处理

3.4结果

3.4 小结

3.5讨论

第四部分 长期使用“佐太”对大鼠肾脏中相关蛋白或酶基因表达水平的影响研究

4.1材料

4.2方法

4.3统计学处理

4.4结果

4.5小结

4.6讨论

第五部分 长期使用“佐太”对大鼠肾脏细胞形态、细胞周期及细胞凋亡的影响研究

5.1材料

5.2方法

5.3统计学处理

5.4结果

5.5 小结

5.6讨论

结论

问题与展望

1、藏药“佐太”中所含汞对其他毒性靶器官的潜在毒性有待于进一步深入研究。

2、藏药“佐太”中其他可能的毒性成分尚未涉及。

参考文献

文献综述:无机汞对肾损伤的机理研究

致谢

在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果

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