足三里穴位局部针刺、艾灸差异响应分子特征

摘要

目的：
　　采用全基因表达芯片结合生物信息学技术，分别构建“足三里”穴位局部对针刺和艾灸两种不同刺激方法响应的差异基因表达谱和分子调控网络，挖掘“足三里”穴位局部对不同刺激的分子响应共性和差异性特征及关键调控靶点，从穴位局部分子响应切入，揭示针刺、艾灸后穴位局部响应的分子事件及其特征，为回答穴位局部在针刺、艾灸刺激后分子水平作用原理提供实验依据，并为进一步筛选针刺与艾灸作用的分子靶点奠定基础。
　　方法：
　　24只SD大鼠随机分为空白组、模型组、模型+针刺组（简称模针组）、模型+艾灸组（简称模灸组），注射弗氏完全佐剂（0.1ml）诱导佐剂性关节炎模型。模针组“足三里”穴位处予针刺15分钟，模灸组施以温和灸15分钟后，立即取各组大鼠“足三里”穴位局部组织，采用Trizol法提取出样品组织总RNA，对样品和共同参照样品用改良的cRNA反转录线性扩增法进行荧光标记，27K大鼠全基因表达谱芯片进行杂交扫描，检测出“足三里”穴位局部全基因表达谱，采用SAM软件，以Foldchange≥2或≤0.5，且∣Score(d)∣≥2为标准筛选差异表达基因，分别构建“足三里”穴位局部对针刺、艾灸响应的差异基因表达谱，运用GO和KEGG数据库对各组差异基因进行生物过程、分子功能和信号通路的富集度分析。采用STEM软件对差异基因进STC趋势分析，挖掘“足三里”穴位局部对针刺、艾灸响应的共同表达、特异表达差异基因，运用boolean函数算法对进行Dynamic-GeneNet基因调控网络构建，并运用Cytoscape和String软件对共同表达、特异表达差异基因及其所编码的蛋白进行蛋白相互作用网络的构建。
　　结果：
　　1.差异表达基因筛选结果
　　①模型组（模型组 VS空白组），“足三里”穴位局部的差异表达基因411个，其中上调287个，下调124个。②针刺后（模针组VS模型组），“足三里”穴位局部的差异表达基因693个，其中上调313个，下调380个。③模灸组（模灸组VS模型组），“足三里”穴位局部的差异表达基因498个，其中上调255个，下调243个。④针刺、艾灸后，“足三里”穴位局部响应的共表达差异基因30个，42个针刺刺激特异响应基因，82个艾灸刺激特异响应基因。
　　2.差异表达基因GO富集度分析结果：
　　对针刺响应的上调的差异表达基因显著富集的生物学过程有39个(p＜0.001)，主要富集于细胞凋亡正调节、程序性细胞死亡正调节、有机循环物质应答、细胞死亡正调节、细胞循环过程等；显著富集的分子功能有14个(p＜0.001)，主要富集于Rho GTP酶催化剂活性、相同蛋白结合、脱氨酶活性、蛋白二聚作用活性、核染质结合等。下调的差异表达基因显著富集的生物学过程有34个(p＜0.001)，主要富集于翻译延伸、炎症应答、细胞自动调节、防御反应、细胞死亡等；显著富集的分子功能有17个(p＜0.001)，主要富集于翻译延伸因子活性、酶抑制剂活性、肽酶抑制剂活性、模式结合、多糖结合等。
　　对艾灸响应的上调的差异表达基因显著富集的生物学过程有26个(p＜0.001)，主要富集于细胞周期、无机物质应答、有机物质应答、细胞循环过程、药物应答等；显著富集的分子功能有14个(p＜0.001)，主要富集于金属离子结合，阳离子结合、离子结合、钙离子结合、蛋白质结合域结合等。下调的差异表达基因显著富集的生物学过程有36个(p＜0.001)，主要富集于免疫应答、防御应答、损伤应答、炎症应答、免疫系统过程正调节等；显著富集的分子功能有19个(p＜0.001)，主要富集于酶结合、细胞因子活性、多糖结合、模式结合、糖类结合等。
　　3.差异表达基因的信号通路（Pathway）富集度分析结果
　　对针刺响应的差异表达基因富集于24个pathway（p＜0.05），按Pvalue排序靠前的有：自然杀伤细胞介导的细胞毒性、肾素血管紧张素系统、肌动蛋白细胞调节骨架、P53信号通路、血管平滑肌收缩等。
　　对艾灸响应的差异表达基因富集于34个pathway（p＜0.05），按Pvalue排序靠前的有：补体及凝血级联反应、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、细胞粘附分子、抗原加工与递呈、T细胞受体信号通路等。
　　4.Dynamic-GeneNet基因调控网络构建结果：
　　共表达差异基因调控网络中，Pla2g2a、Prg4、Aph1b、Mgl1、Serpinb1a等是关键节点；对针刺特异响应基因调控网络中，Jph2、Agt、Casq2、Rhoj、Trf等是关键节点；对艾灸特异响应基因调控网络中，Tnnt2、Lsp1、C1r、Clec4a1、Apobec1等是关键节点。
　　5.蛋白相互作用网络构建结果：
　　共表达差异基因所编码蛋白相互作用网络的关键节点是Ptgs2、Il4、Mmp3、Il13；42个针刺特异响应的基因所编码的蛋白相互作用网络的关键节点是Serpina1、Ren、Igfbp2、Igfbp3、Plg、Ace；艾灸特异响应的基因所编码的蛋白相互作用网络的关键节点是 Serpine1、Timp1、Aurkb、C1r、C1s、Ccl7、Col1a1、Laptm5、Mmp10、Nedd4、Nfkbia。
　　结论：
　　1.“足三里”穴位局部对针刺、艾灸响应的分子共性特征为：多基因、多生物过程、多分子功能、多信号通路参与；多富集于免疫和代谢相关的信号通路。
　　2.“足三里”穴位局部对针刺、艾灸的响应的分子差异特征为：差异表达基因大部分不同；对艾灸响应的差异表达基因富集的信号通路显著与免疫相关。
　　3.Jph2、Agt、Casq2、Rhoj、Trf等基因可能是穴位局部对针刺响应的特异性关键调控基因；Tnnt2、Lsp1、C1r、Clec4a1、Apobec1等基因可能是穴位局部对艾灸响应的特异性关键调控基因；Pla2g2a、Prg4、Aph1b、Mgl1、Serpinb1a等基因可能是穴位局部对针刺和艾灸响应的共同关键调控基因。
　　4.Serpina1、Ren、Igfbp2、Igfbp3、Plg、Ace可能是穴位局部对针刺响应的特异性关键调控蛋白；Serpine1、Timp1、Aurkb、C1r、C1s、Ccl7、Col1a1、Laptm5、Mmp10、Nedd4、Nfkbia等蛋白可能是穴位局部对艾灸响应的特异性关键调控蛋白；Ptgs2、Il4、Mmp3、Il13等蛋白可能是穴位局部对针刺、艾灸响应的共同关键调控蛋白。

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引言

1.研究背景

2.研究内容

3.技术路线

第一部分“足三里”穴位局部对针刺、艾灸响应的差异基因表达谱构建

1.引言

2.实验材料

3 实验方法

4 结果与分析

第二部分“足三里”穴位局部对针刺、艾灸响应的差异表达基因生物信息学挖掘

1.引言

2.数据来源

3.数据分析方法

4.结果与分析

第三部分“足三里”穴位局部对针刺、艾灸响应的分子网络构建

1.引言

2.实验方法

3.实验结果

讨论

1.对穴位局部的认识

2.对针刺、艾灸作用异同的认识

3.足三里选穴依据

4.穴位局部对针刺、艾灸响应的分子特征

5.针刺、艾灸分子响应与神经-内分泌-免疫网络调节

结论

特色与创新

问题与展望

致谢

参考文献

附件一：综述:穴位局部在针灸领域研究概况

附件二：在读期间公开发表的论著及取得的科研成果

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