基于“脑肠菌轴”探讨痛泻要方治疗IBS模型大鼠新机制

摘要

目的：
　　肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)作为典型而常见的情志病，脑肠互动异常已获得中西医学界共识，但是，肠道菌群在IBS发生发展与中药疗效进程中的具体作用机制，仍缺乏研究。本文基于“脑肠菌轴”（Brain-gut–enteric microbiota axis,BGMA）更高更完整之研究视野，一方面更系统深入地揭示IBS病理生物学基础，另一方面以痛泻要方为代表方观察其调控BGMA关键环节和调节模式，探讨中医药防治IBS新机制。
　　方法：
　　选用8周龄SPF级Sprague-Dawley大鼠100只，雌雄各半，给予慢性轻度不可预见性应激联合高糖高脂饲料、高温高湿环境加酒精刺激建立慢性轻度不可预见性应激脾胃湿热泄泻型IBS模型，通过大鼠体重增长率、粪便Bristoi评分、AWR评分及敞箱实验评分，综合评价与鉴定IBS大鼠模型。将造模成功大鼠随机分为模型对照组（M）、痛泻要方7天治疗组（T7）、痛泻要方14天治疗组（T14）、双歧杆菌7天治疗组（B7）、双歧杆菌14天治疗组（B14），加正常对照组共6组。经受试药痛泻要方及阳性对照药物双歧杆菌灌胃7天、14天，实时观察大鼠一般情况、体重增长率、Bristol粪便性状评分、腹壁回撤反射（AWR）评分及敞箱实验评分等指标，验证痛泻要方对IBS模型治疗的有效性。在不同组别特定时间窗口，无菌法采集粪便，经心脏灌洗后取脑组织、结肠组织标本。采用免疫组化法检测大鼠海马区、结肠组织一氧化氮合酶（NOS）、乙酰胆碱转移酶（CHAT）、血管活性肠肽（VIP）、Fos蛋白表达情况，探索痛泻要方对IBS模型“脑肠轴”紊乱的调节机制。提取肠道菌群总RNA、反转录为cDNA，采用实时定量PCR检测肠道菌群色氨酸合成酶基因的表达，探讨痛泻要方对肠道菌群关键性活性物质的影响。提取肠道菌群总DNA，应用Illumina高通量测序平台进行宏基因组测序，通过Blast等比对软件对基因进行NR物种分类、COG、KEGG功能注释，探讨痛泻要方对肠道菌群种类及蛋白、代谢通路功能的影响。
　　结果：
　　1、对IBS模型的评价：与N组比较，IBS模型大鼠精神萎靡、易激惹，弓背，倦怠蜷卧，反应迟钝，活动减少，测定敞箱实验评分明显减少（P<0.05）；食欲减低，检测体重增长率明显降低（P<0.05）；出现不同程度稀便，毛发发黄、污秽、缺少光泽，肛周夹有粘液或体毛被稀便沾染，检测Bristol粪便性状评分、AWR评分均明显增加（P<0.05）。
　　2、痛泻要方对IBS模型大鼠疗效评价：与M组比较，T14、B14组可明显改善IBS模型大鼠精神状态、饮食、毛发等一般情况，体重增长率、敞箱实验评分均明显增加（P<0.05），而Bristol粪便性状评分，AWR均明显降低（P<0.05）；T7、B7组以上指标变化无统计学差异（P>0.05）。
　　3、痛泻要方对IBS模型大鼠海马区、结肠组织CHAT、NOS、VIP、Fos的影响：与N组比较，M组大鼠海马区、结肠组织CHAT、c-Fos、VIP表达明显增加（P<0.05），NOS表达明显降低（P<0.05）；与M组比较，T14、B14组IBS模型大鼠海马区、结肠组织CHAT、c-Fos、VIP表达明显减少（P<0.05），NOS表达明显增加（P<0.05），T7、B7组以上指标变化无统计学差异（P>0.05）。
　　4、痛泻要方对IBS模型大鼠肠道菌群TRPA基因表达的影响：与N组比较，M组大鼠肠道菌群TRPA基因表达水平明显降低（P<0.05）；与M组比较，T14、B14组TRPA基因的表达明显升高（P<0.05），T7、B7组TRPA基因表达变化无统计学差异（P>0.05）。
　　5、痛泻要方对IBS模型大鼠肠道菌群结构的影响：与N组比较，M组大鼠肠道类杆菌门（Bacteroidia）丰度降低、梭状芽孢杆菌门（Clostridia）丰度升高；与M组比较，T7、T14组和B7、B14组类杆菌门（Bacteroidia）丰度均有升高趋势，梭状芽孢杆菌门（Clostridia）丰度均有降低趋势。属水平heatmap显示肠道菌群结构和丰度比较，T7组与B7组有相似性、T14组与B14组有相似性，四个治疗组与N组之间有一定相似性，M组与其他组差异最大。
　　6、痛泻要方对IBS模型大鼠肠道菌群COG聚类的影响：与N组比较，M组大鼠肠道菌群在能量的产生和转化、氨基酸的转运和代谢、碳水化合物的转运和代谢、酶的转运和代谢、脂质的转运和代谢功能COG蛋白功能聚类降低；与M组比较，T7、T14组和B7、B14组以上功能蛋白COG聚类有升高趋势。COG聚类heatmap比较，T7组与B7组有相似性、T14组与B14组有相似性，四个治疗组与N组之间有一定相似性，M组与其他组差异最大。
　　7、痛泻要方对IBS模型大鼠肠道菌群KEGG代谢通路聚类的影响：与N组比较，M组大鼠肠道菌群在ko00970氨酰生物合成、ko00230嘌呤代谢，ko00240嘧啶代谢、ko00640丙酸代谢、ko00030糖磷酸通路、ko00400苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸代谢、ko03020RNA多聚酶代谢的KEGG聚类降低。与M组比较，T7、T14组和B7、B14组以上KEGG聚类有升高趋势。COG聚类heatmap比较，T7组与B7组有相似性，再与M组有一定相似性；T14组与B14组有相似性，再与N组有一定相似性。
　　结论：
　　1、IBS的发病与脑肠轴相关脑肠肽调节紊乱有关，同时，肠道菌群结构、蛋白功能及代谢通路改变也是重要发病机制之一，“脑-肠-菌”轴异常是IBS发病的重要病理基础。
　　2、痛泻要方对IBS模型大鼠治疗效果明显，其机制可能正是通过对“脑-肠-菌轴”的调节来发挥作用。