基于“主客交”理论的加减三甲散对肝纤维化大鼠肝脏蛋白质组影响的实验研究

摘要

目的：
　　观察加减三甲散治疗肝纤维化的疗效，并从蛋白质组层面揭示其作用机制，探索“主客交”理论的现代生物学基础。
　　方法：
　　SPF级Wistar雄性大鼠24只，随机分成正常组、模型组、阳性对照组（复方鳖甲软肝片）、加减三甲散组。常规饲养7d后给模型组、阳性对照组、加减三甲散组采用猪血清腹腔注射复制免疫性肝纤维化模型。造模后各组均灌胃给药，1次/d，三甲散组剂量为8.125g·kg-1，鳖甲片组剂量为0.625g·kg-1,模型组及正常组予0.9％生理盐水等体积灌胃。治疗60d后麻醉处死大鼠取肝脏，HE和MASSON染色观察病理形态，免疫组化CD34标记检测肝脏微血管密度（MVD），ELLISA法检测血清肝功能相关指标、肝纤维化指标，全自动血液流变学检测仪检测血液流变学指标，利用iTRAQ联合LC-MS/MS技术对四组大鼠肝脏进行比较蛋白组学研究，Western blotting法验证部分差异蛋白的表达水平。
　　结果：
　　1.光镜下正常组大鼠肝小叶结构完整，肝细胞未见变性及坏死，无明显纤维结缔组织增生。模型组大鼠肝细胞肿胀，出现脂肪或气球样变，大量纤维组织出现在中央静脉至汇管区，有假小叶形成。加减三甲散组及阳性对照组大鼠肝细胞轻度肿胀，排列紊乱，少量纤维组织增生。与正常组比较，模型组、阳性对照组、加减三甲散组大鼠肝组织炎症活动度分级和纤维化程度分期及胶原纤维面积百分比均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组、加减三甲散组肝组织炎症活动度分级和纤维化程度分期及胶原纤维面积百分比均明显降低（P＜0.05）；阳性对照组与加减三甲散组之间上述指标比较无明显差异（P＞0.05）。
　　2.与正常组比较，模型组、阳性对照组、加减三甲散组大鼠MVD水平显著增高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组、加减三甲散组MVD水平显著下降（P＜0.05）；阳性对照组与加减三甲散组之间MVD水平比较无明显差异（P＞0.05）。
　　3.与正常组比较，模型组大鼠血清AST、ALT、GLB水平均明显升高（P＜0.05）；与模型组大鼠比较，加减三甲散组及阳性对照组大鼠血清AST水平显著下降，阳性对照组大鼠血清GLB水平显著下降（P＜0.05）；阳性对照组与加减三甲散组之间大鼠血清AST、ALT、GLB、ALB及A/G水平比较无明显差异（P＞0.05）。
　　4.与正常组比较，模型组大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平均明显升高（P＜0.05），加减三甲散组及阳性对照组大鼠血清PCⅢ、HA水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，加减三甲散组及阳性对照组大鼠血清HA、LN、PCⅢ水平明显下降（P＜0.05）。
　　5.与正常组比较，模型组大鼠全血高切粘度(200S-1)、全血低切粘度(5S-1)、红细胞压积、血沉均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，三甲散组及阳性对照组大鼠全血高切粘度(200S-1)、全血低切粘度(5S-1)、红细胞压积、血沉水平明显下降（P＜0.05）。阳性对照组与加减三甲散组之间大鼠全血高切粘度(200S-1)、低切粘度(5S-1)、红细胞压积、血沉水平比较无明显差异（P＞0.05）。
　　6.本次研究共筛选出108个差异表达蛋白。在模型组与正常组比较中，共有72个差异表达蛋白，其中29个蛋白表达上调，43个蛋白表达下调；在加减三甲散组与模型组比较中，共有43个差异表达蛋白，其中19个蛋白表达上调，24个蛋白表达下调；同时在模型组与正常组比较、加减三甲散组与模型组比较中均有差异的蛋白有7个。主要包括涉及机体代谢的酶蛋白，其次是机体免疫系统相关蛋白，参与细胞发育调控的蛋白及一些生物调节相关蛋白等。
　　7.模型组与空白组比较，Cofilin2和NADH dehydrogenase在模型组表达下调，ACSM3在模型组表达上调；加减三甲散组与模型组比较，Cofilin2和NADH dehydrogenase在加减三甲散组表达上调，ACSM3在加减三甲散组表达下调。Western blotting验证结果与蛋白组学研究结果一致。
　　结论：
　　1.采用猪血清腹腔注射法可成功复制大鼠免疫性肝纤维化模型。
　　2.加减三甲散可改善肝纤维化模型大鼠病理形态、部分血清肝纤维指标及肝功能指标及血液流变性指标。
　　3.采用iTRAQ联合LC-MS/MS技术共鉴定并筛选出108个差异表达蛋白，这些差异表达蛋白可能通过交互作用共同体现“主客交”理论部分内涵。
　　4.Cofilin2、ACSM3及NADH dehydrogenase可能是加减三甲散治疗肝纤维化的关键作用靶点，值得进一步深入研究。

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引言

第一部分 文献研究

1 肝纤维化疾病的现代医学认识

2 传统医学对肝纤维化疾病的认识

3 “主客交”理论与肝纤维化关系

4 蛋白质组学技术在肝纤维化研究中的应用

第二部分 实验研究

1 免疫性肝纤维化大鼠模型的建立及加减三甲散干预作用

2 基于iTRAQ联合LC-MS/MS技术研究加减三甲散对免疫性肝纤维化大鼠肝脏蛋白质组的影响

结论

特色与创新

问题与展望

参考文献

综述: 蛋白质组学技术在肝纤维化研究中的应用

致谢

攻读学位期间主要研究成果

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