白芍总苷对肺纤维化Th17/Treg相关细胞因子的调节及抑制MRC-5增殖的机制研究

摘要

目的：观察白芍总苷对人胚肺成纤维细胞MRC-5增殖的作用，进一步研究白芍总苷对博莱霉素诱导的肺纤维化模型小鼠Th17/Treg相关因子的影响，初步探讨白芍总苷阻抑肺纤维化的可能机制，为临床上防治肺纤维化提供初步的基础理论与动物实验依据。
　　方法：1.用不同剂量白芍总苷（0.5mg·L-1、2.5mg·L-1、12.5mg·L-1、62.5mg·L-1、125mg·L-1）处理MRC-5细胞24h、48h、72h。MTT比色法检测白芍总苷对MRC-5增殖的影响，绘制时间浓度抑制曲线，筛选白芍总苷（62.5mg·L-1、125mg·L-1）干预MRC-5细胞48h。流式细胞术检测细胞周期分布；TUNEL法和Annexin V-FITC/PI双染法检测MRC-5细胞凋亡；采用 RT-PCR法检测 TGP对细胞周期调节蛋白CyclinD1、CDK4 mRNA的影响；蛋白印迹法观察各组细胞TGF-β1的表达。
　　2.C57BL/6J雌性小鼠49只，随机分成7组：肺纤维化模型组7只，给予2.5 g·L-1博莱霉素稀释液，持续雾化总时间8h。空白对照组7只，给予等量生理盐水雾化8h；白芍总苷低中高剂量组各7只，博莱霉素雾化同模型组，将白芍总苷用0.5%羟甲基纤维素钠稀释后灌胃（0.27mg·g-1·d、0.81mg·g-1·d、2.43mg·g-1·d）。吡非尼酮组7只，博莱霉素雾化同模型组，同时将吡非尼酮配成吡非尼酮溶液灌胃（0.09mg·g-1·d）。白芍总苷+吡非尼酮组7只，博莱霉素雾化同模型组，将吡非尼酮（0.09mg·g-1·d）和白芍总苷（0.81mg·g-1·d）配成混合溶液灌胃。均为每天1次，连续30天。实验结束时称重后，摘眼球取血，ELISA检测血浆IL-17、TGF-β、IL-6、IL-10；采用HE染色法和Masson染色法观察小鼠肺组织病理形态改变及纤维化程度；采用免疫组化法检测小鼠肺组织IL-17A、TGF-β1表达；采用RT-PCR法检测小鼠肺组织IL-17A、TGF-β1、RoRγt、Foxp mRNA水平。
　　结果：1.随着TGP浓度的升高和处理时间的延长，MRC-5细胞增殖抑制率逐渐增加。在共同培养48h后，TGP62.5mg·L-1、125mg·L-1处理组G1期细胞数量、凋亡指数、凋亡率增加，G2、S期细胞数量、CyclinD1、CDK4 mRNA及TGF-β1蛋白表达水平降低，与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），并且TGP125mg·L-1作用效果强于TGP62.5mg·L-1（P＜0.05）。
　　2.与空白对照组比较，C57BL/6J小鼠模型组肺系数、肺组织内羟脯氨酸含量增加，Ashcroft评分增加，TGF-β1、IL-17A蛋白表达升高，血浆IL-17、TGF-β1、IL-6水平升高，IL-10水平降低，肺组织IL-17A、RORγt、TGF-β1 mRNA表达水平增加，Foxp3 mRNA表达水平降低（P＜0.05）。与模型组比较，白芍总苷治疗各组、吡非尼酮组、白芍总苷+吡非尼酮组肺系数、羟脯氨酸含量均降低（P＜0.05），白芍总苷各治疗组之间肺系数、羟脯氨酸含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），与吡非尼酮组比较，白芍总苷+吡非尼酮组肺系数、羟脯氨酸含量进一步降低(P＜0.05)。与模型组比较，治疗各组肺纤维化Ashcroft评分降低；与白芍总苷高剂量组之间比较，吡非尼酮组肺纤维化评分降低（P＜0.05），与吡非尼酮组比较，白芍总苷+吡非尼酮组评分进一步降低（P＜0.05）。与模型组比较，白芍总苷各治疗组、吡非尼酮组、白芍总苷+吡非尼酮组TGF-β1、IL-17A蛋白表达呈下降趋势；与吡非尼酮组比较，白芍总苷+吡非尼酮组TGF-β1、IL-17A蛋白表达进一步降低（P＜0.05）。与白芍总苷低剂量相比，白芍总苷中、高剂量组血浆IL-17、IL-6水平降低，IL-10水平升高(P＜0.05)，与白芍总苷各剂量组比较，吡非尼酮组TGF-β1水平降低(P＜0.05)，与白芍总苷中、高剂量组相比，吡啡尼酮组小鼠血浆中IL-10浓度升高(P＜0.05)，与吡非尼酮组比较，白芍总苷+吡非尼酮组血浆IL-17、IL-6、TGF-β1水平进一步降低，IL-10浓度进一步升高(P＜0.05)。与空白对照组比较，模型组小鼠肺组织IL-17、TGF-β1、RoRγt mRNA表达水平升高，Foxp3 mRNA表达水平降低(P＜0.05)；与模型组比较，白芍总苷各剂量治疗组、吡非尼酮组、白芍总苷+吡非尼酮组IL-17、TGF-β1、RoRγt mRNA表达水平不同程度降低，Foxp3 mRNA表达水平升高；且白芍总苷+吡非尼酮组作用强于吡非尼酮组（P＜0.05）。
　　结论：1.TGP能抑制MRC-5细胞增殖，其作用机制可能与阻碍细胞周期进展、抑制细胞增殖及促进细胞凋亡有关。
　　2.雾化吸入博莱霉素可成功建立肺纤维化模型。白芍总苷联合吡非尼酮对博莱霉素诱导的肺纤维化模型小鼠有一定的改善作用，可能与调控Th17/Treg相关细胞因子及上游特异性关键转录因子有关。通过抑制Th17/Treg相关细胞因子IL-17、TGF-β1、IL-6表达，增加IL-10表达，抑制其上游转录因子RORγt mRNA表达、增加Foxp3 mRNA表达，对肺纤维化防治和减缓肺纤维化进程具有一定作用。

目录

缩略词表

前言

第一部分 白芍总苷对人胚肺成纤维细胞MRC-5增殖和凋亡的影响

1 材料

2 实验方法

3 统计分析

4 结果

5讨 论

第二部分 白芍总苷对C57BL/6J小鼠肺纤维化模型Th17/Treg相关细胞因子的影响

1 材料

2 实验方法

3 统计分析

4 结果

5讨论

结论

问题与展望

致谢

参考文献

附件1辅助性T细胞应答在肺纤维化发生、发展过程中作用的研究进展

附件2论文附图

附图一

附图二

附图三

附图四

附图五

附件3在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果（示例）

声明