Oct4联合小分子化合物诱导肝细胞重编程为胰腺干祖样细胞

摘要

目的:
　　1、探讨在Oct4介导下小鼠原代肝细胞发生去分化的细胞形态及基因表达的变化趋势,探索肝细胞去分化后向胰腺干祖样细胞诱导的合适时机。
　　2、应用小分子化合物将去分化的肝细胞诱导为胰腺干祖样细胞。
　　方法:
　　第一部分:分离培养小鼠原代肝细胞,构建慢病毒表达质粒pWPT-Oct4,包装表达Oct4的慢病毒,将其感染原代肝细胞,观察细胞的形态变化,用RT-PCR法监测nestin、ALB、AFP以及Foxa2的表达并进行半定量分析。用RT-PCR法监测“中间状态细胞”标志物:SOX17,HNF6,HNF1β,SOX9的表达趋势,结合细胞形态的变化,探索肝细胞去分化后向胰腺干祖样细胞诱导的合适时机。
　　第二部分:根据SOX9的表达,联合应用小分子化合物:表皮生长因子(EGF),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),Exendin-4等对去分化后的肝细胞进行诱导,观察细胞形态,用RT-PCR及免疫荧光染色法检测胰腺干细胞标志物CK19、ABCG2的表达。
　　结果:
　　第一部分:感染Oct4-慢病毒后,原代肝细胞胞内颗粒逐渐释放出来,在第7天时细胞的增殖能力有所增强。RT-PCR结果显示,感染Oct4-慢病毒后,成熟肝细胞的标志物ALB表达减弱,不成熟肝细胞标志物AFP、Foxa2表达增强,表明肝细胞发生去分化,细胞成熟表型逐渐丢失。在此过程中,多谱系前体细胞标志物nestin表达逐渐增强,从第3天持续至第9天,从第12天起开始减弱。在感染Oct4-慢病毒后第2天可检测到HNF1β,HNF6的表达,第6天可检测到SOX9的表达。
　　第二部分:在SOX9开始表达的第6天起,用小分子化合物诱导去分化的肝细胞生成胰腺干祖样细胞,在诱导4天后细胞呈集落样生长,可检测到胰腺干细胞标志物CK19、ABCG2的表达。
　　结论:
　　在基因Oct4及小分子化合物联合诱导下,肝细胞经去分化可进一步向胰腺谱系诱导。本实验探索了体外产生胰腺干细胞的新途径,为扩大胰岛移植的来源和实现糖尿病的β细胞替代治疗提供了实验依据。

目录

封面

声明

目录

英文缩略词表

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分Oct4基因介导小鼠原代肝细胞去分化的相关研究

1.资料与方法

1.1 实验材料

1.2实验方法和步骤

2.结果

2.1 pWPT-Oct4表达载体的酶切鉴定

2.2 慢病毒滴度测定

2.3 小鼠原代肝细胞的形态观察

2.4 Oct4-慢病毒感染肝细胞

2.5 监测肝细胞去分化过程的基因表达

2.6 监测肝细胞去分化过程中“中间状态细胞”标志物的表达

3.讨论

参考文献

第二部分小分子化合物将去分化的肝细胞诱导为胰腺干祖样细胞

1．资料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法和步骤

2.结果

2.1 胰腺干祖样细胞的诱导及形态观察

2.2 检测各组细胞中CK19的表达

2.3 检测胰腺干祖样细胞的基因表达

2.4 免疫荧光染色检测CK19的表达

3.讨论

参考文献

结论

综 述

攻读学位期间发表文章情况

致 谢