抗粘附分子CD146单克隆抗体AA98对脓毒症小鼠保护作用的初步研究

摘要

研究目的:观察抗粘附分子CD146单克隆抗体(AA98)对脓毒症小鼠的保护作用，探索在外科手术基础上联合应用抗粘附分子和/或抗内毒素单抗进行脓毒症外科综合治疗的新模式． 研究方法: 1、采用肓肠结扎穿孔后8h行盲肠切除和腹腔生理盐水灌洗的方法，建立适用于外科综合治疗研究的改良小鼠脓毒症模型。 2、利用本室现有的可持续分泌特异性鼠抗人CD146分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株(AA98)，制备小鼠腹水型抗体，经Protein A亲和层析和超滤获得纯化抗体蛋白；以10％SDS聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳鉴定其纯度；以Western-blotting法鉴定其特异性；Bradford法测定其蛋白浓度；快速试纸鉴定其Ig亚类，间接ELISA方法检测单克隆抗体AA98的效价。 3、128只小鼠制备改良脓毒症模型，随机分为四组：A组(生理盐水治疗组)、B组(AA98单抗治疗组)、C组(抗内毒素单抗体M2b治疗组)和D组(AA98+M2b联合治疗组)。A组动物于术后2和/或6h尾静脉注射等体积的0.9％氯化钠注射液。B组动物分别于术后2h、6h尾静脉注射单抗AA98各4mg/kg；C组动物术后2h尾静脉注射单抗M2b2mg/kg；D组动物于术后2h尾静脉注射单抗M2b2mg/kg和单抗AA984mg/kg，术后6h尾静脉注射单抗单抗AA984mg/kg。观察术后各组动物24、48、72、96h累计死亡率，于术后12、24h处死动物抽血，查血清内毒素(LPS)、肿瘤坏死因子(TNF-α)水平及外周血白细胞计数(WBC)，光镜下观察肺，肝组织病理改变。 研究结果: 1、改良小鼠脓毒症模型的建立，相当于对原有盲肠结扎穿孔动物进行手术处理，因此动物出现死亡时间明显延迟，早期死亡率明显降低，但72h动物死亡率仍稳定在80％，动物外周血WBC、血清LPS、TNF-α水平较假手术组明显升高(P＜0.05)，术后24h动物肺、肝组织已出现继发性病理损害。 2、获得的杂交瘤腹水经Protein A亲和层析法纯化，抗体蛋白纯度较某国产商品化抗体纯度高，通过超滤法浓缩的抗体蛋白浓度达1.804mg/ml，经Western blotting鉴定表明制备的腹水型单克隆抗体AA98能与高表达CD146分子的黑色素瘤A375细胞培养上清特异性结合，快速试纸鉴定其Ig亚类为Ig2a，间接ELISA方法检测其效价为1：20000。 3、对盲肠结扎穿孔制备的脓毒症小鼠行原发灶切除后，分别给予抗内毒素(M2b)和/抗粘附分子(AA98)治疗，A组对照动物术后48、72h累计死亡率分别为60％、80％；而单独给予抗内毒素单抗治疗后动物48、72h累计死亡率35％、60％，单独给予抗粘附分子单抗治疗后动物48、72h累计死亡率分别为35％、55％，两单抗联合治疗后动物48、72h累计死亡率分别为30％、50％，均显著低于A组对照(P＜0.05)；且两单抗联合治疗较单独治疗动物48、72h累计死亡率有所降低；给予抗内毒素和/或抗粘附分子治疗后动物12、24h血清LPS、TNF-α水平及外周血WBC均显著低于A组(P＜0.05)，且两单抗联合治疗较单独治疗有所降低；给予抗内毒素和/或抗粘附分子治疗后动物24h肺，肝组织的病理改变较A组显著减轻，且两单抗联合治疗较单独治疗效果更为明显。 研究结论: 1、对肓肠结扎穿孔动物8h后进行盲肠切除和腹腔生理盐水灌洗处理，明显延迟了动物出现死亡的时间，降低了动物早期(24h)死亡率，可以满足脓毒症综合治疗研究疗效观察的需要。 2、在手术治疗的基础上，对脓毒症小鼠给予AA98单抗治疗，可以明显减轻全身炎症反应及重要器官的损害，降低动物中晚期(48、72h)死亡率，明显延长动物生存时间。表明抗粘附分子CD146单克隆抗体AA98对脓毒症小鼠具有保护作用。 3、对脓毒症小鼠给予AA98单抗和M2b单抗联合治疗，较单独给予抗粘附分子或抗内毒素单抗治疗，更显著地降低了动物中晚期死亡率，对脓毒症治疗效果更加明显。因此，在外科手术基础上，联合应用抗粘附分子和/或抗内毒素单抗可作为脓毒症外科综合治疗的新模式。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩写索引

声明

前言

第一部分 改良小鼠脓毒症模型的建立

材料

方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 抗粘附分子CD146单克隆抗体AA98的制备

材料

方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 抗粘附分子CD146单克隆抗体AA98对脓毒症小鼠的保护作用

材料

方法

结果

讨论

参考文献

全文小结

综述：脓毒症相关问题研究进展

攻读学位期间发表文章

致谢