骨髓间充质干细胞移植对大鼠胃癌前病变模型的干预和机制的初步探讨

摘要

研究背景:
　　胃癌前病变是胃粘膜从正常向胃癌转化过程中的一个重要阶段,是一个多因素、多步骤的长期演变过程。大部分胃癌的发生经历了包括萎缩、肠上皮化生和异型增生等癌前病变过程。研究癌前病变,监测并防止癌前病变向癌转化已受到许多学者的关注。骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMMSCs)是一种来源于中胚层的成体干细胞,具有很强的自我更新和多向分化潜能,在组织修复、免疫调节和内环境稳定方面发挥作用。BMMSCs的移植已广泛应用于许多疾病的预防和治疗中,成为组织工程学理想的种子细胞。目前BMMSCs在胃疾病的报道多集中在胃损伤方面的研究中。当胃粘膜发生癌前变化时,胃上皮和腺体发生不同程度的损伤、炎症及其他病理性变化。损伤和炎症反应能刺激BMMSCs的释放和归巢,局部微环境也对归巢的BMMSCs产生重要影响。
　　实验目的:
　　通过观察BMMSCs移植后胃癌前病变的变化,探索BMMSCs移植对胃癌前病变的干预及机制,为临床应用奠定了一定的理论基础。
　　实验内容:
　　1.采用MNNG法和MNNG与Hp相结合的方法分别复制大鼠和沙鼠胃癌前病变模型,比较两种模型方法,选用可行的动物模型进行胃癌前病变的实验研究。
　　2.观察大鼠BMMSCs的生长情况和生物学特性,建立稳定的大鼠BMMSCs分离、培养和扩增体系。
　　3.静脉移植BMMSCs进入胃癌前病变的动物模型体内,通过示踪标记的细胞,了解移植细胞对胃癌前病变的影响,并初步探讨移植细胞对病变组织影响的机制。
　　实验方法:
　　1.胃癌前病变模型的建立:方法一:选取6周龄wistar雄性大鼠,按编号随机分为空白对照组和模型组。空白对照组大鼠饮用清洁自来水,模型组大鼠饮用含MNNG100mg/l的蒸馏水(MNNG避光保存,每周换液1次)。于造模2月后每月处死模型组大鼠1-2只,了解造模情况。造模成功后,将模型组大鼠随机分为非细胞移植组和细胞移植组,空白对照组大鼠随机分为空白组和对照组;并按实验要求处死空白组大鼠和非细胞移植组大鼠并比较其胃组织病理情况。方法二:蒙古沙鼠按随机编号分为空白组和模型组,空白组沙鼠饮用清洁自来水,模型组沙鼠饮用含MNNG300mg/l的蒸馏水10周,间隔1周后给予Hp菌液(109CFU/ml.只)经口灌胃,每周灌胃1次,共灌胃4次,此后饮用清洁自来水,于造模8个月后每月处死沙鼠1只,了解造模情况。
　　2.建立稳定的BMMSCs体外扩增体系:采用骨髓贴壁法体外分离培养并扩增wistar大鼠的BMMSCs,倒置显微镜下观察细胞形态学特点,MTT法测定细胞生长曲线,台盼蓝染色排斥试验检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞表面标记物和细胞周期,体外定向诱导BMMSCs向脂肪细胞和成骨细胞分化。
　　3.CM-dil标记细胞的体外观察及移植细胞对病变组织的影响和机制:用CM-dil标记P3代大鼠BMMSCs,体外观察标记细胞的荧光强度、标记率、活性和增殖能力。细胞移植组大鼠按2-3×106/ml.只的浓度经尾静脉注射CM-dil标记的BMMSCs,每周注射1次,共注射3次。对照组大鼠2只经尾静脉注射等体积的生理盐水,2只经尾静脉注射同等浓度的BMMSCs。在第3次注射后第1-7天分别处死大鼠。HE染色观察细胞移植组和对照组胃组织的病理学变化,荧光显微镜下观察胃组织冰冻切片中CM-dil阳性细胞的定植,免疫荧光法检测定植BMMSCs在胃组织的分化情况,免疫组化法检测胃组织VEGF的表达情况,流式细胞仪检测外周血的IL-10、IL-4、IFN-γ及IL-17的含量。
　　实验结果:
　　1.(1)大鼠胃癌前病变模型共造模10个月。空白对照组大鼠胃粘膜呈浅红色,表面光滑,弹性好,腺体排列密集,可见散在的少量淋巴细胞,未见明显萎缩、肠化、异型增生及肿瘤形成。部分非细胞移植组大鼠胃粘膜呈苍白色或可见有红白相间粘膜,皱襞减少,可见较多炎细胞浸润,固有层腺体减少或腺体结构较紊乱,形状欠规则,核增大、深染、排列较乱。在非细胞移植组大鼠胃粘膜中,炎症发生11例,萎缩7例(其中胃体轻度萎缩3例,窦体交界轻度萎缩2例,中度萎缩1例;胃窦轻度萎缩3例),肠化3例(其中胃体轻度肠化1例,窦体交界轻度肠化1例,胃窦轻度肠化1例),异型增生8例(其中胃体轻度异型增生3例,中度异型增生3例;窦体交界轻度异型增生3例;胃窦轻度异型增生6例)。非细胞移植组大鼠炎症、萎缩、异型增生发生率分别为100％,64%,27%和73%,萎缩+肠化+异型增生的总发生率为90.9%。
　　(2)沙鼠胃癌前病变模型共造模12个月。空白组沙鼠胃粘膜表面光滑,色红,未见萎缩、肠化及异型增生的发生。模型组沙鼠胃粘膜灰白,皱襞消失,可见多个慢性炎性细胞浸润,甚至可见成堆炎性细胞聚集灶;部分胃粘膜可见腺体减少、灶状肠化生或形状稍不规则的腺管,细胞核略增大、深染。模型组沙鼠炎症发生10例,溃疡1例,萎缩6例(胃体5例,胃窦1例),轻度肠化2例,轻度异型增生4例(胃体3例,胃窦1例)。模型组沙鼠炎症、萎缩、肠化、异型增生发生率分别为100%、60%、20%、40%,萎缩+肠化+异型增生的总发生率为90%。
　　2.原代培养的BMMSCs接种24小时后贴壁生长,3-5天可见成纤维样细胞集落,约10-12天后细胞基本融合呈单层并铺满皿底。P3代以后的BMMSCs形态均一,多数为成纤维样梭形。培养第1-2天为细胞生长潜伏期,3-9天为指数增长期,此后为细胞生长平台期。活细胞比例达90%以上,绝大多数BMMSCs处于G0/G1期。细胞表面抗原CD90、CD44、CD29表达阳性,CD45表达阴性。在体外诱导培养下,BMMSCs具有多向分化潜能,可向成骨细胞和脂肪细胞分化。
　　3.体外培养条件下,CM-dil未对BMMSCs形态和增殖产生明显影响。P3代BMMSCs状态良好,形态均一,呈梭形漩涡状贴壁生长。荧光显微镜下,标记的P3代BMMSCs发出与细胞膜轮廓一致的红色荧光。标记的BMMSCs尾静脉移植到大鼠胃癌前病变模型后,可见部分细胞移植组大鼠的腺上皮消失、固有层腺体减少及炎细胞浸润,但其炎症程度较非细胞移植组减轻。细胞移植组大鼠炎症发生11例,萎缩5例(其中胃体轻度萎缩3例,胃窦轻度萎缩2例,中度萎缩1例),无肠化及异型增生发生。对照组大鼠胃腺体排列紧密,可见散在的淋巴细胞,未见明显萎缩、肠化、异型增生及肿瘤形成。细胞移植组大鼠胃体和胃窦的冰冻切片中发现红色荧光的标记细胞,部分定植的BMMSCs的cytokeratin抗原和vimentin抗原阳性,提示BMMSCs在体内环境中能分化为胃上皮细胞和间质细胞。免疫组化提示模型组和细胞细胞移植组的VEGF表达较对照组升高,且细胞移植组VEGF表达高于非细胞移植组VEGF的表达(P<0.05)。流式细胞仪检测提示非细胞移植组和细胞移植组血清中的IL-17和IFN-γ含量较对照组升高,差异有统计学意义(P<0.05),细胞移植组IL-17和IFN-γ含量较非细胞移植组低(P<0.05)。但对照组、非细胞移植组和细胞移植组三者之间的IL-4和IL-10比较均无统计学意义。
　　实验结论:
　　1.相较于沙鼠的胃癌前病变模型,MNNG法复制的大鼠胃癌前病变模型的病理形态和形成过程与人胃癌前病变相似,病变发生于胃体和胃窦,且操作简单易行,因此是制备胃癌前病变模型的可靠方法。
　　2.骨髓贴壁法可成功分离和培养出大鼠BMMSCs,分离所得的细胞性状稳定、状态良好,形态学和表型符合间充质干细胞特点,且具有多向分化潜能。
　　3.定植于胃癌前病变处BMMSCs通过分化为胃组织的目的细胞,上调病变区VEGF的表达和下调血清中IL-17和IFN-γ的含量等免疫调节作用,稀释和减少促炎因子的释放,缓解炎症,从而可能缓解胃癌前病变的发展。

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英文缩略词表

中文摘要

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前言

第一部分 胃癌前病变动物模型的建立与比较

材料与方法

结果

讨论

小结

参 考 文 献

第二部分 大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养、纯化和鉴定

材料和方法

结果

讨论

小结

参 考 文 献

第三部分 骨髓间充质干细胞移植对大鼠胃组织病理变化的影响及机制的初步探讨

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

全文小结

文 献 综 述骨髓间充质干细胞在消化道疾病中的应用

参考文献

攻读学位期间发表论文情况

致谢