骨肉瘤肿瘤血管生成与微血管密度在瘤体内的分布差异研究

摘要

目的：观察人骨肉瘤与荷人骨肉瘤皮下移植瘤瘤体内不同区域VEGF和微血管密度(microvessel density，MVD)的分布是否存在差异，分析瘤体内不同区域VEGF表达与MVD的关系，为临床上骨肉瘤标本取材部位的确定以及有关骨肉瘤肿瘤血管生成的临床与基础研究提供实验参考。 方法： 1.选取3例经手术切除的完整的骨肉瘤标本，以肿瘤中心为原点建立空间坐标系，在垂直轴、矢状轴、冠状轴上以1cm为基本单位取空间坐标点。肿瘤标本根据所取坐标点依次切取组织块，所有组织块均用10％福尔马林液固定，石蜡包埋。应用所有石蜡包埋的组织块制作组织芯片，芯片上每点直径1.0mm，点间距0.5 mm。每个肿瘤制作一个芯片矩阵，矩阵中每点代表一个石蜡包埋的组织块。组织芯片5μm厚切片，应用免疫组化技术，VEGF多克隆抗体标记VEGF，CD34单克隆抗体标记微血管，检测芯片上每个肿瘤组织点VEGF的表达，计数MYD，计算VEGF阳性目标积分光密度。参考Ma及孟悛非等对骨与软组织肿瘤边缘与中心区域的定义，把骨肉瘤标本所有点分为3组。取肿瘤的最大内切圆的圆心(O)作为其中心，在病灶边缘任意取点A～G，自O向病灶边缘各点作放射状连线，然后取每条线段的中内1/3点、中外1/3点，将每条线段等分为3份。分别连接中内l/3点、中外1/3点，形成大小不等的、与肿瘤外形相似的同心圆，将病灶分为3个部分，其中内侧部为肿瘤的内层，外侧部为肿瘤的外层，两层之间的部分为肿瘤的中层。即将肿瘤所有点分为内层、中层、外层3组。内层代表肿瘤的“中心区域”，外层代表肿瘤的“边缘区域”，中层代表二者交界区。 2.建立荷骨肉瘤裸鼠动物模型：采用骨肉瘤细胞系MG-63，0.2ml细胞悬液(约1×106个细胞)/只注射到20只裸鼠腋背部皮下，一周后成瘤，二周后切取肿瘤。选取12个大小均(1.0s*1.0*1.0cm3)的移植瘤标本切取8um厚冰冻切片，应用免疫组化技术，VEGF多抗标记VEGF，CD34标记微血管，检测VEGF表达，计数MVD。冰冻切片要求：按顺序切片，标记清楚；标本每隔1mm连续切取2-4张切片。每张CD34单抗、VEGF多抗标记的冰冻切片均以其中心为原点左右上下移动，每移动1mm确定为一个空间坐标点，并在显微镜下对该坐标点拍照计算MVD、VEGF阳性目标积分光密度，最后将一个肿瘤的所有空间坐标点还原成一个完整肿瘤标本，每个坐标点代表肿瘤的不同空间位置，对每个点进行分析时除外肿瘤坏死组织。参考等对骨与软组织肿瘤边缘与中心区域的定义，把移植瘤标本分为2组。以肿瘤的中心为圆心(O)，以5mm为直径的圆形区域以内为肿瘤内层，圆形区域以外为肿瘤外层。即将肿瘤划分为内层、外层2组。内层代表肿瘤的“中心区域”，外层代表肿瘤的“边缘区域”。上述图像数据分析均采用MoticMed6.0图像处理软件，包括微血管密度计数(MVD)，VEGF表达的量化值(阳性目标积分光密度)。 结果： 1.3个人骨肉瘤标本分析结果一致，即外层与中层VEGF表达、MVD分布差异无统计学意义(P>0.05)，内层与外层、中层之间VEGF表达、MVD分布差异显著，有统计学意义(P<0.01)。人骨肉瘤瘤体边缘区域的VEGF表达、MVD均高于肿瘤中心区域。在骨肉瘤瘤体内层、中层与外层VEGF表达与MVD均呈正相关，即瘤体外层、中层VEGF表达高微血管分布较多，内层VEGF表达低微血管分布较少。 2.骨肉瘤移植瘤标本分析结果为，移植瘤外层、内层之间VEGF表达、MVD分布差异显著，有统计学意义(P<0.01)。瘤体边缘区域(或外周)VEGF表达及MVD均高于中心区域(或内部)。在瘤体内层外层VEGF表达与MVD均呈正相关，即瘤体外层VEGF表达高微血管分布较多，内层VEGF表达低微血管分布较少。 结论：人体骨肉瘤和荷人骨肉瘤裸鼠皮下移植瘤的瘤体内，不同区域的VEGF表达和MVD的分布存在差异。在临床上对骨肉瘤标本送病理时，即使肿瘤中心区域没有坏死，也应取材肿瘤边缘组织，以有利于肿瘤的病理学分析；在对骨肉瘤标本进行肿瘤血管生成的相关研究时，应标明取材部位，避免因瘤体内部微血管的分布差异而引起的实验偏差。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

第1章 人骨肉瘤瘤体内VEGF与MVD的分布差异研究

引言

材料与方法

结果

第2章 荷人骨肉瘤裸鼠皮下移植瘤瘤体内VEGF与MVD的分布差异研究

引言

材料与方法

结果

第3章 实验讨论

全文总结

参考文献

致谢

骨肉瘤肿瘤血管生成的研究进展

个人简历 在读期间发表的学术论文与研究成果