膀胱癌EJ细胞WIF-1基因的表现遗传学研究

摘要

基因的表观遗传学修饰包括DNA甲基化和组蛋白的共价修饰，两者是染色质重塑的关键机制。研究表明，肿瘤细胞中某些异常沉默的抑癌基因存在着表观遗传学修饰改变。在抑癌基因沉默过程中，DNA甲基化与组蛋白修饰之间有着复杂的功能联系，本研究拟从DNA甲基化和组蛋白乙酰化两个方面，对人膀胱癌EJ细胞株抑癌基因WIF-1的表观遗传学标记进行研究，并观察DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2｀-脱氧胞苷(5-aza-2｀-deoxycytidine，5-Aza-CdR)对WIF-1基因启动子区异常甲基化状态的影响以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A(TrichostatinA，TSA)对WIF-1基因启动子区组蛋白H3第9位赖氨酸(H3-K9)乙酰化状态的影响，从而探讨该基因DNA异常甲基化和组蛋白H3-K9乙酰化在膀胱癌发生发展中的可能作用及其与基因异常表达的关系，为更好的揭示膀胱癌中抑癌基因的表观遗传学紊乱机制以及寻找膀胱癌新的治疗靶点提供实验依据。
　　 5-Aza-CdR对EJ细胞增殖及WIF-1基因异常甲基化的影响
　　 目的：观察5-氮杂-2｀-脱氧胞苷(5-aza-2｀-deoxycitydine，5-Aza-CdR)对体外培养的膀胱癌EJ细胞增殖、细胞周期影响及其对EJ细胞中WIF-1基因的甲基化状态的影响。
　　 方法：不同浓度5-Aza-CdR处理体外培养膀胱癌EJ细胞后，用MTT法检测药物处理24，48和72h后的细胞增殖活性；用PI染色和流式细胞仪检测药物处理72h后的细胞周期分布；MSP法检测用药前后细胞中WIF-1基因的甲基化状态；Real-timePCR法检测用药前后细胞中WIF-1的mRNA表达变化。
　　 结果：5-Aza-CdR处理膀胱癌EJ细胞后，细胞增生受到抑制，有一定的时间和剂量依赖性。流式细胞仪分析表明，不同药物浓度处理EJ细胞72h后细胞增殖指数降低明显：5，10μmol/L组分别为34.09±0.79％，28.55±1.76%，与对照组(42.78±1.23%)相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。在5-Aza-CdR处理前，膀胱癌EJ细胞中WIF-1基因的mRNA表达水平较低，经过5-Aza-CdR处理后，WIF-1基因在膀胱癌EJ细胞中甲基化状态得到了逆转，WIF-1基因的mRNA表达水平升高。
　　 结论：5-Aza-CdR对膀胱癌EJ细胞具有增生抑制作用；WIF-1基因的表达情况可能与其甲基化状态的改变有关。
　　 TSA对膀胱癌EJ细胞增殖、WIF-1基因组蛋白H3-K9乙酰化状态和基因表达的影响
　　 目的：观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A(Trichostatin A， TSA)对体外培养的膀胱癌EJ细胞增殖情况及WIF-1基因表达的影响，并探讨其可能的作用机制。
　　 方法：MTT法检测不同浓度的TSA对人膀胱癌EJ细胞增殖的影响；流式细胞术检测处理后膀胱癌EJ细胞周期分布的变化；Real-time PCR法检测用药前后细胞中WIF-1的mRNA表达变化；染色质免疫沉淀技术分析干预前后WIF-1基因启动子区组蛋白H3第9位赖氨酸(H3-K9)的乙酰化状态。
　　 结果：TSA体外能明显抑制EJ细胞生长，且抑制作用有一定的时间和剂量依赖性。流式细胞术检测示不同药物浓度处理EJ细胞72h后细胞增殖指数降低明显：0.2，0.4，0.8μmol/L组分别为36.27±0.71%，26.37±1.34%，19.83±2.00%，与对照组(42.78±1.23%)相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。TSA可明显提高WIF-1基因启动子区组蛋白H3-K9的乙酰化水平，并使WIF-1的mRNA表达水平升高。
　　 结论：TSA对膀胱癌EJ细胞具有增生抑制作用，其作用机制可能涉及WIF-1基因启动子区组蛋白H3-K9乙酰化水平的升高及该基因的表达水平升高。