镰形扇头蜱抗微生物多肽基因的克隆及序列分析

摘要

蜱是一类以吸血为生的节肢动物，是人和动物的许多病原的传播媒介，包括细菌、真菌、病毒、立克次体、螺旋体和寄生原虫等多种病原。在中国，已记录的蜱类近120种，其中10余种具有明显的医学重要性，了解病原在蜱体的传播机制，特别是病原体与蜱的相互作用关系，对于蜱和蜱传病的防治具有重要价值。抗微生物多肽作为蜱的先天性免疫效应分予之一，是研究蜱与病原体的相互作用的重要切入点。 木实验以镰形扇头蜱吸血前后雄蜱唾液腺的抑制消减杂交cDNA文库中的EST数据为基础，从镰形扇头蜱体内克隆出M200和M50二个新基因。M200基因全长542bp，编码100个氨基酸，预测分了量为9.85kDa，，含有典型的信号肽序列，经同源性比较，该基因编码蛋白与与微小牛蜱抗微生物多肽分子Ixodidin序列的显著同源。M50基因全长410bp，编码100个氨基酸，预测分子量为9.0kDa，含有典型的信号肽序列，无显著性同源分子，仅与单一异尖线虫蛋白酶抑制因子有低度同源。结构上，M200和M50预测蛋白都含有半胱氨酸的抗微生物多肽的典型特征，即在C-末端含有6个保守的半胱氨酸残基(C…CXXXC…C…CXC)，形成一个称为CS αβ(cysteine-stabilized αβ)稳定的基序(motif)。综合同源性、结构特征、分子量、信号肽等生物信息学分析结果，初步预测M200和M50为二个编码镰形扇头蜱抗微生物多肽的新基因。 应用RT-PCR方法分析了M200和M50基因在蜱的不同组织器官和不同发育阶段的表达情况。结果表明，这二个基因的表达没有组织特异性；M200在蜱的各个发育阶段卵、幼蜱、若蜱和成蜱均有表达，但M50在蜱的卵、若蜱阶段没有表达。 应用RT-PCR方法分析了M200和M50基因在蜱的吸血前后的表达模式。M200和M50基因在蜱吸血后的转录量显著高于未吸血蜱，说明这两个基因的表达与吸血有关。 成功构建了重组表达载体pGEX-4T-1/M200和pGEX-4T-1/M50，并转化到表达苗BL21中，经IPTG诱导，结果表明M200和M50可以在原核表达系统中高效表达，应用GST融合蛋白纯化系统，可获得纯化的目的蛋白。 综上所述，本研究首次克隆、表达了镰形扇头蜱二个新基因，生物信息学分析表明它们可能是二个编码镰形扇头蜱抗微生物多肽。研究结果，为进一步研究这二个分子的生物学功能打下基础。

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论文说明：主要符号表

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第一章概述

1.1前言

1.2 抗微生物多肽的研究进展

第二章材料与方法

2.1材料与试剂

2.2镰形扇头蜱的实验室饲养

2.3镰形扇头蜱总RNA的提取及鉴定

2.4镰形扇头蜱M50与M200基因的克隆

2.5RT-PCR分析M50与M200基因的表达特点及分布情况

2.6 镰形扇头蜱M50与M200基因的原核表达

2.7 融合蛋白的纯化

2.8重组蛋白抗血清制备和Westen blot分析

第三章结果与分析

3.1镰形扇头蜱的实验室饲养

3.2 总RNA的提取

3.3 目的基因M200 3端的克隆

3.4 全长基因的克隆

3.6 基因的原核表达

3.7 重组蛋白浓度的测定

第四章讨论

4.1 镰形扇头蜱的实验室饲养

4.2 RNA提取及检测

4.3 RACE方法克隆M200基因

4.4 RT-PCR方法分析M50与M200基因表达模式

4.5 外源基因在E.coli中的表达

第五章结论

致谢

参考文献

附录

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