水稻Gt1启动子引导大豆Gy7基因表达载体构建及转化水稻研究

摘要

作物蛋白是人类和动物日常所需营养物质的主要来源，却因其缺乏某些必需氨基酸而存在营养不均衡的现象。利用传统育种难以有效地提高作物必需氨基酸的含量，现代分子生物学技术的发展为快速有效地改良作物的营养品质开辟了新途径。本文综述了近年来利用基因工程技术提高作物营养品质的研究进展，并开展了利用转基因技术改良水稻稻米蛋白质品质的试验研究。 本研究首先从越光水稻基因组中克隆了5.3kb谷蛋白Gtl基因5'上游和信号肽序列，将其定向插入到pCAMBIA1300质粒中，构建了中间载体pCAMBIAl300-5.3kbGtl；再将本实验室已克隆的大豆球蛋白Gy7基因插入在pCAMBIAl300质粒上的5.3kbGtl启动子下游，构建成由长Gtl启动子引导Gy7基因的安全性表达载体pCAMBIA1300-5.3kbGtl-cy7，以期利用优质大豆球蛋白Gy7基因来达到改良水稻稻米营养品质的目的。考虑到转基因安全性的问题，该载体在构建过程中去除了35S启动子以及抗性选择标记基因。 5.3kb长启动子的成功克隆还为今后将水稻种子作为生物反应器研究奠定了基础。在本研究中成功构建的pCAMBlA1300-5.3kbGtl-Gy7表达载体，为利用转基因技术，在国内外首次将富含赖氨酸的优质大豆球蛋白Gy7基因导入水稻，改良稻米营养品质完成了重要的前期工作。 在表达载体成功构建的基础上，利用根癌农杆菌介导的共转化法，将含有p1300-HWG双元载体(含有潮霉素抗性基因、gus报告基因)和已构建的pCAMBIAl300-5.3kbGtl.Gy7质粒(只含有目的基因)的根癌农杆菌以1:9浓度配比混合后共转化水稻超2-10幼胚诱导形成的愈伤组织，经抗性筛选获得具有再生能力的愈伤67块，每块愈伤再生苗数为1-13棵，总计255棵苗生根，其中有3棵未能存活。T0代转基因水稻植株总DNA经PCR检测，结果显示，有9块经根癌农杆菌感染的愈伤组织分化再生的23株水稻基因组含有Gy7目的基因，共转化率为13.43％(共转化率=共转化愈伤组织数/再生出苗的愈伤组织总数)。Southern blot杂交分析证实，pCAMBlAl300-5.3kbGtl-Gy7载体T-DNA已整合入水稻基因组中。含目的基因转基因水稻幼嫩种子经RT-PCR检测，结果显示，大豆Gy7基因能够在转基因水稻种子中转录，并能够对内含子进行剪切。GUS检测6块共转化愈伤组织再生的13棵转基因植株T1代种子，从中筛选出不含p1300-HWGgus报告基因的阴性种子，利用1/2MS发苗获得6个转基因T1株系后代。采用PCR检测6个转基因T1株系植株Gy7基因，有5个转基因株系后代基因组中含有Gy77目的基因。开展本试验为今后继续筛选大豆球蛋白Gy7目的基因不再分离的纯合体后代，获得不含有抗性标记基因，并且具有高赖氨酸含量的优质蛋白质品质水稻新型种质资源奠定了重要的前期工作基础。 为了比较同样由5.3kbGt1启动子引导大豆球蛋白Gy7基因全序列和cDNA序列在提高稻米蛋白质含量和质量的效果，本研究又从高蛋白大豆南农87C-38未成熟子叶中提取RNA，并利用RT-PCR获得了Gy7 cDNA序列。经生物公司测序后，利用vector NTI软件将Gy7全基因及本试验克隆的cDNA序列与Genbank(AF319776和AF319777)报道的Gy7基因序列进行比对分析，同源性分别为99％和99.6％。然后，在本试验已制备的中间载体pCAMBIA1300-5.3kbGt1基础上，又构建了由水稻谷蛋白Gt1长启动子及信号肽引导的Gy7 cDNA序列的新表达载体：pCAMBIA1300-5.3kbGt1-Gy7 cDNA。该载体今后可用于利用农杆菌介导的共转化法将其导入水稻，为进一步探索利用大豆球蛋白Gy7基因改良水稻等谷类作物营养品质研究奠定了基础。 开展本试验，为利用转基因技术，在国内外首次利用从谷蛋白含量相对较高的越光水稻品种中克隆的5.3kb长Gt1启动子，将富含赖氨酸的优质大豆球蛋白Gy7基因导入水稻提高稻米营养品质完成了重要的前期工作。

目录

论文说明：中英文对照

声明

致谢

摘要

利用基因工程技术改良作物蛋白质品质的研究进展

摘要

前言

1直接导入表达富含必需氨基酸的天然优质蛋白质基因

1.1在种子中表达

1.2在叶片组织中表达

2通过蛋白工程进行蛋白质分子设计提高蛋白质中的必需氨基酸含量

2.1蛋白质序列的修饰

2.2人工合成优质蛋白质基因

2.3同源蛋白质基因表达的修改

3通过代谢工程增加游离的必需氨基酸

4结合代谢工程与导入富含必需氨基酸优质蛋白基因实现增加必需氨基酸的来源和沉积

5通过调控内源基因表达以实现增加或降低某些蛋白组分的方式改变作物营养品质

6小结与展望

第二部分：研究论文水稻Gt1启动子引导大豆Gy7基因表达载体构建及转化水稻研究

摘要

前言

一、水稻5.3kbGt1启动子克隆以及Gt1启动子引导优质大豆球蛋白Gy7全基因表达载体构建

材料与方法

结果与分析

二、利用共转化法将优质大豆球蛋白Gy7全基因导入水稻

材料和方法

结果与分析

三、大豆11S球蛋白Gy7基因cDNA序列的克隆及含有Gy7 cDNA的安全性表达载体构建

材料与方法

结果与分析

讨论

1.利用转基因技术改良水稻品质启动子的选用

2.农杆菌介导转化水稻外源基因拷贝数分析

3.采用基因工程技术改良水稻营养品质

4.基因全序列和eDNA序列转基因研究对外源基因表达的影响

5.转基因水稻的安全性及本试验工作的展望

参考文献

附录：水稻转化相关培养基

研究生期间论文及研究成果