egfp在集胞藻6803中克隆及其表达调控研究

摘要

自1968年蓝藻被证实具有遗传重组现象开始，越来越多的人致力于蓝藻基因工程研究。随着蓝藻基因工程的发展，有一批外源基因被导入到蓝藻中表达。主要涉及环境治理、代谢调控、营养保健品和基因工程药物表达等应用领域。但是，外源基因表达效率低下的瓶颈制约了蓝藻基因工程的发展，无法实现规模化生产应用。 影响基因表达的因素有很多。如：基因拷贝数、密码子偏好性、启动子、终止子、反义RNA技术以及蛋白表达策略等。本研究试图从选择启动子、改变SD序列入手，对改进蓝藻外源基因表达系统和提高外源基因表达效率做一些探讨。 集胞藻6803(Synechocystis sp.strain PCC6803)是一种单细胞蓝藻，具有生长速度快、培养条件简单、不产生毒素、细胞结构简单、遗传背景清楚、方便分子操作等的特点，在特殊培养条件下还可以进行异养生长，非常适合于利用光合生物反应器大规模生产。因此，集胞藻6803是种很好的蓝藻基因工程受体。 本研究选择集胞藻6803染色体DNA中cupA基因及其下游相连的两个片段分别作为上游整合平台(up)和下游整合平台(down)，在二者间插入诱导型高效启动子、egfp(增强型绿色荧光蛋白基因)报告基因、卡那霉素抗性筛选标记，构建得到集胞藻6803同源重组双交换整合平台。 在整合平台的基础上，通过更换启动子和进行SD序列距离修饰，共得到6个带启动子和1个不带启动子的转化载体。把转化载体分别自然转化到野生型集胞藻6803中，经卡那霉素筛选得到7个转基因藻。它们分别含有能够被红光诱导的Popeβ(转pK-Pcpcβ集胞藻6803和转pK-Pcpcβ2集胞藻6803)、被温度诱导的PgroESL(转pK-PgroESL，集胞藻6803和转pK.PgroESL2集胞藻6803)、被光照诱导的PpsbA(转pK-PpsbA集胞藻6803和转pK-PpsbA2集胞藻6803)和1个不带启动子的转pK-P0集胞藻6803。 根据启动子的不同诱导特性，分别设计梯度诱导条件诱导EGFP表达，通过检测EGFP(增强型绿色荧光蛋白)荧光检测分析。EGFP在488nm光激发下会辐射绿色荧光，利用激光共聚焦显微镜对藻细胞直接进行荧光活性检测。通过比较EGFP的检测结果，判断各转基因藻外源基因表达系统的表达效率。 本实验主要结果或结论：1.构建得到6个带启动子的转化载体；2.构建得到1个不带启动子的转化载体；3.通过自然转化获得了7个转基因藻株；4.PgroESL具有温度诱导增强表达作用；5.SD序列修饰具有上调表达作用。

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文摘

英文文摘

论文说明：主要符号表

声明

第一章文献综述

1.1蓝藻基因工程

1.2蓝藻外源基因表达效率影响因素

1.3研究内容

1.4研究目的及意义

1.5技术路线图

第二章材料与方法

2.1材料

2.2方法

第三章分子克隆结果

3.1含cpcβ启动子载体构建

3.2含groESL启动子载体构建

3.3含psbA启动子载体构建

3.4转化载体pK-PO构建

第四章转基因藻获得

4.1转pK-Pcpcβ集胞藻6803获得

4.2转pK-Pcpcβ2集胞藻6803获得

4.3转pK-PpsbA集胞藻6803获得

4.4转pK-PpsbA2集胞藻6803获得

4.5转pK-PgroESL集胞藻6803获得

4.6转pK-PgroESL2集胞藻6803获得

4.7转pK-P0集胞藻6803获得

第五章表达调控结果

5.1含PgroESL转基因藻诱导表达

5.2生物活性检测

第六章分析与讨论

6.1集胞藻6803同源重组双交换整合平台构建

6.2 EGFP在集胞藻6803中作为报告基因蛋白的方便检测性

6.3启动子(PgroESL)对EGFP表达的影响

6.4 SD序列修饰对EGFP表达的影响

第七章总结与展望

7.1总结

7.2展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果