ADH高产醋酸杆菌AbI-9-3菌株选育、提取工艺、稳定性及解酒药效学研究

摘要

乙醇脱氢酶能够以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为辅酶，催化乙醇生成乙醛，再由乙醛脱氢酶转化为乙酸，并最终生成二氧化碳和水。醋酸杆菌通过大量产生乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶把乙醇转化成乙酸而应用于食醋的工业化生产。本课题以提高乙醇脱氢酶产量为目的，对醋酸杆菌C118进行了菌种选育和诱变株AbI—9-3的发酵工艺研究，初步确立了适用于工业化生产的乙醇脱氢酶提取方法和大幅提高酶活的激活稳定剂配方，并在优化ADH解酒效果动物试验模型的基础上进行了解酒效果的研究，为酶制品的研发打下了良好的基础。 实验采用醋酸杆菌C118为出发菌株，通过紫外诱变、化学诱变和高浓度乙醇驯化结合紫外诱变等方法，以产酸能力和单位体积湿菌体得率为指标，筛选得到4株优良菌株，选取其中两项指标均优良的一株作为目的菌株，并将其定名为AbI—9-3。通过对培养条件的优化确定了醋酸杆菌AbI—9-3菌株培养基配方和摇瓶发酵工艺条件。其中最佳培养基为：酵母膏3％，葡萄糖1％，碳酸钙0.6％，乙醇5％。在接种量为10％、温度35℃、转速200转/min，发酵24小时时加入诱导剂乙醇，发酵48小时，最大发酵产量为24.03g/L，ADH最高酶活性为9300U/ml，比C118提高了3.04倍。本试验还探索了酸碱指示剂甲基红在初筛实验中的应用，根据菌落大小和指示剂颜色的变化挑选高产菌株，为醋酸杆菌的诱变育种工作提供一个简便、高效的初筛实验方法。 以ADH活性为指标对ADH的提取纯化工艺进行了研究，找到了一种简单高效的ADH提取方法——有机溶媒法来破碎细胞，条件为—20℃预冷的丙酮迅速处理，置冰箱—20℃静置2小时，结果有机溶剂丙酮破壁效果良好，酶活性回收率达到了溶菌酶法的90％以上。同时又探讨了ADH的精提工艺，得出1～1.5倍的丙酮可以有效沉淀ADH酶蛋白，且酶活保留率在80％以上，杂质去除率也在较高范围内。经Sephadex—G100凝胶柱层析得到了纯化的ADH。 分别考察了盐、糖醇、酸、氨基酸、维生素、抗氧保护剂及金属离子对ADH常温下的激活作用和高温下的保护作用，优选出了4种激活稳定剂，并确定了它们的最佳浓度，即0.03M的甘氨酸、0.5M的山梨醇、50～100mM的KCI和20mM的碳酸钙。最后用正交试验作进一步考察，最终得出1 mM KCI、0.03 M甘氨酸、1M山梨醇和20 mM的碳酸钙对ADH具有显著保护作用。 通过筛选和造模，建立了一个较为理想的评价ADH解酒效果的动物模型，并将该模型应用于预试和正式试验，得到了较好的实验结果。初步确定了ADH的有效剂量为15000U/Kg。急性毒性试验结果表明，小鼠对ADH的最大耐受剂量为20g/Kg。 通过本次研究，完善了醋酸杆菌的诱变育种方法，并筛选得到了ADH高产菌株，优选出了醋酸杆菌的培养基配方和发酵工艺条件，找到了适于工业生产的提取纯化方法和有效保护ADH活性的酶稳定剂，通过动物试验确定了ADH的有效剂量和最大耐受量，为ADH解酒制剂的开发提供了药学、药效学和毒理学依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章综述

1 ADH应用研究现状

1.1 ADH生物电极和乙醇生物传感器

1.2 ADH在化学工业中的应用

1.3 ADH在食品科学和医药研究中的应用

1.4 ADH在生物科学中的应用

2解酒制品类型

2.1按ADH解酒机理分类

2.2按中西医解酒方法分类

2.3国内外解酒制品简介

3.ADH的分离纯化研究现状

3.1盐析沉淀法

3.2有机溶剂沉淀法

3.3疏水层析

3.4亲和层析法

3.5凝胶层析

4酶稳定性的研究进展

4.1化学修饰

4.2稳定添加剂

5本课题研究的主要内容及创新点

5.1课题提出的意义

5.2本课题主要研究内容

5.3本课题的创新点

5.4本课题研究的流程图

第二章醋酸杆菌的诱变育种及其发酵培养基配方优化

1材料、试剂与仪器

1.1材料、试剂

1.2主要仪器

2实验方法

2.1诱变育种

2.2发酵培养基配方优化

3结果与讨论

3.1诱变育种

3.2发酵培养基配方优化结果

4小结

第三章ADH的提取及分离纯化

1材料、试剂与仪器

1.1主要材料和试剂

1.2主要仪器

2实验方法

2.1瓦勒-霍赫法测定酶活

2.2 ADH的提取工艺研究

2.3 ADH的沉淀除杂工艺研究

2.4 Sephadex-G100柱层析纯化工艺研究

3结果与讨论

3.1 ADH的提取工艺研究结果

3.2 ADH沉淀除杂工艺研究结果

3.3 ADH柱层析纯化研究结果

3.4层析液ADH活性检测结果

4小结

第四章ADH稳定剂的筛选研究

1材料、试剂与仪器

1.1主要材料和试剂

1.2主要仪器

1.3溶液配制

2实验方法

3结果与讨论

3.1 ADH激活剂的筛选结果

3.2 ADH保护剂的筛选结果

3.3稳定剂浓度对ADH稳定性的影响结果

3.4复合稳定剂对提高ADH稳定性影响的正交试验研究结果

4小结

第五章小鼠口服ADH的解酒作用与急性毒性试验研究

1材料、试剂与仪器

1.1材料、试剂

1.2主要仪器

2实验方法

2.1溶液的配制

2.2 ADH对醉酒小鼠的解酒作用研究

2.2 ADH的小鼠最大耐受量试验

3结果与讨论

3.1小鼠口服ADH的给药剂量预试实验结果

3.2小鼠口服ADH解酒作用的实验结果

3.3 ADH的最大耐受量实验研究结果

4小结

结论及展望

参考文献

作者简介及代表性学术论文(专利)目录

致谢