三分三毛状根中托品烷生物碱不同成分间的生物转化研究

摘要

托品烷生物碱(tropane alkaloids)是一类作用于副交感神经系统的抗胆碱药,广泛地存在于茄科植物中,包括:山莨菪碱(anisodamine)、樟柳碱(anisodine)莨菪碱(hyoscyamine)和东莨菪碱(scopolamine)。其中,莨菪碱和东莨菪碱已经被长期大量地应用,但是随着科技地不断发展,山莨菪碱和樟柳碱的功能渐渐被发现,他们除了具有抗胆碱的活性外,还具有改善微循环的作用,临床可用于治疗微循环障碍性疾病；还可用来治疗青光眼等。此外,他们还对油酸所引起的急性肺损伤和急性肾衰时肾微血管的损伤具有保护作用。最重要的是,与东莨菪碱相比,山莨菪碱毒性低,对中枢神经的副作用小。因此,四种生物碱都具有巨大的医用和商业价值。
　　 三分三(Anisodus acutangulus)是我国云南特有的茄科多年生的药用植物,由于它可以产生较高含量的托品烷生物碱而被重视。尤其是三分三中的莨菪碱,是所有茄科植物中最高的,但是其他三种托品烷生物碱含量却很低,因此,利用基因工程手段来提高山莨菪碱,樟柳碱,东莨菪碱的研究是具有重要价值的。
　　 首先,本研究利用从药用植物三分三根部克隆得到的限速酶基因AaPMT和AaTRI基因的编码框序列构建含AaPMT和AaTRI基因的植物双价高效表达载体,通过发根农杆菌介导,对三分三外植体进行双基因转化,从而获得转AaPMT和AaTRI基因的三分三毛状根,通过半定量和定量RT-PCR的方法分析目的基因在转基因毛状根中的表达情况,高效液相色谱法测定转基因毛状根中托品烷生物碱(莨菪碱,山莨菪碱,樟柳碱和东莨菪碱)含量。本课题获得的三分三转基因毛状根中托品烷生物碱的平均含量明显提高,其中的一个株系(PT18),其托品烷生物碱含量为对照的8.7倍,特别是东莨菪碱和樟柳碱,他们的含量提高最为明显,分别为对照组的49.8和19.6倍。而且通过抗氧化研究实验得知,转基因株系中由于托品烷生物碱的含量的提高导致了其抗氧化能力也大大提高了。因此,这个课题提供了一种提高三分三毛状根中托品烷生物碱含量和抗氧化能力的方法,从而为临床所需求的托品烷生物碱提供了更多的来源和巨大的商业需求。
　　 其次,本研究验证了AaTRI对托品烷生物碱含量的影响。构建两个植物表达载体,分别含AaTRI(正)、AaTRI(反)基因的编码框序列,然后分别导入发根农杆菌,从而获得转基因毛状根系。转AaTRI(正)基因的毛状根中托品烷生物碱的平均含量较对照明显提高,其中的一个株系(T12),其托品烷生物碱含量为对照的2.8倍。相反,转AaTRI(反)基因的毛状根中托品烷生物碱的平均含量较对照明显降低,其中的一个株系(T21反),其托品烷生物碱含量为对照的11.6％。由以上结果可得出托品烷生物碱含量从高到低排列为:AaTRI(正)的毛状根>非转基因毛状根>含AaTRI(反)的毛状根。
　　 再次,我们还把不同浓度的四种托品烷生物碱的标准品分别加入到了含有非转基因三分三毛状根的培养基中,共培养一段时间后,通过RT-PCR的方法分析托品烷生物碱代谢通路中关键酶基因的表达情况,高效液相色谱法测定加入底物后的毛状根中托品烷生物碱(莨菪碱,山莨菪碱,樟柳碱和东莨菪碱)含量。结果表明,所加入的托品烷生物碱标品都会大大增加毛状根中山莨菪碱,樟柳碱和东莨菪碱的含量,尤其是当把10μM东莨菪碱标品加入到培养基中,毛状根中的东莨菪碱和樟柳碱的含量提高最为明显,分别为对照组的7.2和8.1倍。同时根据基因表达谱和生物碱含量分析,我们提出了樟柳碱可能的代谢途径。因此,这个课题不但提供了一种除了转基因方法之外的另外一种提高三分三毛状根托品烷生物碱含量方法,而且对樟柳碱和东莨菪碱之间的转化关系进行了进一步研究。

目录

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缩写词表

第一章 文献综述

1.1 生物碱概述

1.2 托品烷生物碱

1.2.1 樟柳碱

1.2.2 山莨菪碱

1.2.3 莨菪碱

1.2.4 东莨菪碱

1.3 托品烷生物碱合成的进一步研究

1.4 药用植物三分三简介

1.5 提高托品烷生物碱含量的方法

1.5.1 诱导法

1.5.2 基因工程方法

1.5.3 反义RNA或RNAi干扰

1.5.4 调控转录因子法

1.5.5 生物转化法

1.6 本课题研究的目的和意义

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 载体及菌种

2.1.3 主要仪器设备

2.1.4 购买的试剂、酶及药品等

2.1.5 常用试剂

2.2 AaPMT和AaTRI的植物双价表达载体的构建

2.2.1 载体pCAMBIA1304+的构成

2.2.2 pCAMBIA1304++AaPMT+AaTRI植物双价表达载体的构建

2.2.3 三分三的遗传转化

2.3 AaTRI正、反植物表达载体的构建及遗传转化

2.3.1 AaTRI正、反植物表达载体的构建

2.3.2 C58C1介导的三分三遗传转化

2.4 托品烷生物碱不同成分之间的生物转化研究

2.4.1 向非转基因三分三毛状根中添加山莨菪碱、樟柳碱和东莨菪碱标品

2.4.2 经过处理后的毛状根的表达谱分析

2.4.3 利用HPLC检测经过处理的毛状根中托品烷生物碱的含量

第三章 结果与讨论

3.1 托品烷生物碱四种成分的标准品HPLC标准曲线和HPLC图谱

3.2 AaPMT和AaTRI双基因共转化三分三

3.2.1 pCAMBIA1304++AaPMT+AaTRI的植物双价表达载体的构建

3.2.2 转基因毛状根的PCR验证

3.2.3 转基因毛状根的形态学特征

3.2.4 转基因毛状根基因表达谱分析

3.2.5 转基因毛状根中的托品烷生物碱的含量分析

3.2.6 DPPH清除自由基法测定托品烷生物碱的抗氧化活性

3.2.7 以上转基因毛状根的结果分析

3.3 AaTRI正、反基因分别转化三分三

3.3.1 AaTRI正、反植物表达载体的构建

3.3.2 转基因毛状根的获得及其结果分析

3.4 三分三非转基因毛状根中托品烷生物碱不同成分间的生物转化

3.4.1 添加山莨菪碱标品对毛状根中托品烷生物碱含量的影响

3.4.2 添加樟柳碱、东莨菪碱标品对毛状根中托品烷生物碱含量的影响

第四章 总结与展望

4.1 研究结论

4.2 后续研究方向

参考文献

硕士期间发表的论文及成果

致谢