大鼠SNAT1中二硫键数量和位置的初探

摘要

本文对大鼠SNAT1中二硫键数量和位置进行了研究。中性氨基酸转运蛋白1(SNAT1)是哺乳动物体内一种重要的中性氨基酸转运蛋白，属于SLC38家族。SNAT1含有十一个跨膜区域，在转运氨基酸的同时协同转运一个Na+，参与机体的很多重要生理活动，主要介导谷氨酰胺从星形胶质细胞到神经细胞的转运。它的功能紊乱会导致许多神经退行性疾病。为了进一步研究SNAT1的结构和功能，我们通过PCR，酶切，连接的方法分别将HA抗体标签与SNAT1 C端相连，EGFP抗体标签与SNAT1 C端相连，并将融合蛋白构建在真核细胞表达载体pBK－CMV(△[1098－1300])上，获得质粒pBK－CMV△-SNAT1－HA和pBK－CMV△－SNAT1－EGFP，在此基础上可通过激光共聚焦电子显微镜(LCM)观察以及生物素标记分析可确定SNAT1定位在细胞膜上，并可通过Western Blot检测SNAT1及其突变型在细胞中的表达量。SNAT1中含有10个半胱氨酸(Cys)，我们使用Pfu酶对这十个Cys分别进行C-A(丙氨酸，Ala)定点突变。将各种突变型转染HEK293T细胞，发现各单C－A突变型对SNAT1的表达基本没有影响，但是C477对SNAT1在细胞膜上的定位可能有一定影响。mPEG5000-mal可以与巯基发生偶合。Western Blot结果显示，只用mPEG5000-mal修饰的SNAT1条带明显低于用DTT处理后再用mPEG5000-mal修饰的条带。用IA修饰SNAT1之后，除去IA再用DTT处理并用mPEG5000-mal修饰，条带显著高于只用IA修饰的SNAT1，由此说明SNAT1中存在二硫键。对野生型和十种突变型SNAT1进行直接的mPEG5000-mal修饰，将条带进行对比可以估测野生型SNAT1被修饰上7个mPEG5000-mal，C245A和C262A突变型被修饰上8个mPEG5000-mal，C389A突变型被修饰上7个mPEG5000-mal，其他7种突变型均被修饰上6个mPEG5000-mal，由此推测，SNAT1中C245和C262之间可能形成了二硫键，C389也非自由半胱氨酸，可能被某种小分子修饰。