诺加霉素产生菌中诺加糖与诺加糖胺生物合成基因功能的研究

摘要

诺加霉素是由黑胡桃链霉菌(Streptomyces nogalater)ATCC27451发酵产生的重要葸环类抗生素。它对多种肿瘤细胞具有强抑制活性（例如其对于白血病L1210细胞的ID50只有0.09nmol/mL），且具有抗革兰氏阳性菌作用。诺加霉素结构复杂，与柔红霉素、表阿霉素、阿霉素和阿克拉霉素结构极其相似，其葸环苷元结构上，有三个与诺加糖胺(Nogalamine)、诺加糖(Nogalose)相结合的位点，并且含有一个独特的蒽环骨架与糖基以C-C键缩合成并环的结构。
　　 诺加霉素生物合成途径已被初步推测，控制其生物合成的基因簇已被识别与克隆。为了验证这些基因与诺加霉素生物合成的关系，本研究通过中断此基因簇中部分基因SnogK（推知的在形成诺加糖及诺加糖胺过程中起作用的葡萄糖脱氢酶基因）、SnogA(形成诺加糖胺过程中起作用的氨基甲基化酶基因)、SnogC(在形成诺加糖过程中起作用的脱氢鼠李糖还原酶基因)，考察这些基因的中断对诺加霉素生物合成的影响，并希望得到诺加霉素类似物。我们首先构建了基因中断质粒pLMX-3-58-A、pLMX-3-58-C和pLMX-3-58-K，通过接合转移将pLMX-3-58-A、pLMX-3-58-C和pLMX-3-58-K导入筛选出的高产稳定的产诺加霉素的出发菌株ATCC27451，通过同源重组分别得到基因中断突变株mLMX-3-59-A，mLMX-3-59-C，mLMX-3-59-K。我们在mLMX-3-59-K的发酵液中检测到一个新组分K，同时诺加霉素的产生被中断;mLMX-3-59-A中原有组分诺加霉素已不再产生;mLMX-3-59-C中原有组分诺加霉素的产生未被中断。
　　 蒽环类药物具有多功能分子结构，其发色团周围糖基部分结构的微小变化均可导致其作用机制，药代动力学毒性及抗肿瘤活性等多方面的显著差异。如果我们使用柔红糖胺氨基转移酶基因dnrJ（功能一致，酶作用立体选择性相反）替换负责催化诺加糖胺形成的氨基转移酶基因snogI，我们将构建可能产生表异构诺加糖胺结构诺加霉素的突变株。论文第二部分我们构建完成了用于基因置换的重组质粒pLMX-3-96，它的双交换同源重组左右臂中间，顺序插入红霉素抗性基因启动子基因ErmP和dnrJ基因。通过接合转移将其转入高产稳定的产诺加霉素菌株。经过同源重组，基因组DNA上的snogI基因被dnrJ基因所置换，通过筛选得到snogI基因被dnrJ基因所置换的突变株mLMX-3-100。突变株经过发酵发酵培养后，对发酵液进行了处理检测，未发现有预期产物诺加糖胺氨基表异构化的诺加霉素类似物出现，并且未检测到原有组分诺加霉素。
　　 我们的工作为今后深入研究诺加霉素生物合成基因的功能和采用组合生物合成技术改造诺加霉素提供了参考。

目录

摘要

英文缩写说明

第1章 绪论

1．1 蒽环类抗生素简介

1．2 诺加霉素的生物合成途径

1．3 链霉菌中的基因中断和基因置换

1．3．1 同源重组单交换

1．3．2 同源重组双交换基因置换

1．4 选择方法时的考虑因素

1．5 葸环类抗生素产生菌的基因工程改造

1．6 立题依据

第2章 snogA、snogC、snogK基因功能的研究

2．1 仪器和材料

2．1．1 质粒

2．1．2 菌种

2．1．3 培养基

2．1．4 主要溶液和缓冲液

2．1．5 主要生化试剂

2．1．6 培养基成分

2．1．7 主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 菌种的培养和保藏

2．2．2 链霉菌总DNA的抽提

2．2．3 大肠杆菌感受态的制备

2．2．4 大肠杆菌质粒转化

2．2．5 大肠杆菌质粒的抽提

2．2．6 DNA片段的回收

2．2．7 单一PCR片段或酶切片段的回收

2．2．8 PCR反应体系

2．2．9 单交换插入失活质粒的构建

2．2．10 黑胡桃链霉菌与E．coli ET12567(pUZ8002)的接合转移

2．2．11 单交换基因突变株的筛选

2．2．12 HPLC的检测方法和条件

2．2．13 黑胡桃链霉菌及突变株的发酵

2．2．14 核酸片段的脱磷反应与回收

2．2．15 菌株的自然分离

2．3 结果

2．3．1 snogA，snogC和snogK基因的克隆和序列同源性比对

2．3．2 重组质粒的构建及酶切验证

2．3．3 重组菌株的获得

2．3．4 重组菌株的基因型验证

2．3．5 单交换突变株的发酵

2．4 本章小结

第3章 dnrJ原位置换转氨酶基因snogI的研究

3．1 材料和方法

3．1．1 部分仪器、材料和方法参照2．1和2．2

3．1．2 质粒和菌种

3．1．3 双交换基因突变株的筛选

3．2 结果

3．2．1 用于基因置换的重组质粒的构建

3．2．2 dnrJ基因置换snogI基因突变株的筛选

3．2．3 dnrJ基因置换snogI基因突变株的发酵

3．3 本章小结

全文总结

致谢

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

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