氨基甲基化酶编码基因snogA中断对诺加霉素生物合成的影响

摘要

诺加霉素是重要的蒽环类抗肿瘤抗生素,蒽环类抗生素是一类重要的抗肿瘤抗生素,其中柔红霉素,阿霉素和表阿霉素在临床上应用广泛。诺加霉素是一种由黑胡桃链霉菌ATCC27451发酵产生的新型蒽环类抗生素,对多种肿瘤细胞具有较强抑制活性,其生物合成途径中诺加糖胺的氨基甲基化过程促进诺加糖胺的形成和稳定,是诺加霉素发挥其抗肿瘤活性的一个重要前提。本研究从诺加霉素产生菌中克隆得到560bp的氨基甲基化酶(snogA)编码基因片段,利用EcoRⅠ/HindⅢ双酶切,并将其插入同样酶切位点的基因整合型质粒pKC1139的多克隆位点,构建得到基因中断质粒pLMX-3-58.分别提取野生型菌株和基因中断突变株mLMX-3-58的基因组DNA为模板,扩增基因组整合片段两端序列。电泳结果表明该片段含有部分同源重组序列和部分质粒序列,完全符合预期结果,表明质粒pLMX-3-58在相应位置正确整合,将SnogA基因中断。而以野生型基因组DNA为模板的阴性对照组没有扩增到任何片段。将基因中断质粒转化至大肠杆菌,得到重组菌株E.coliET12567/pLMX-3-1作为供体菌,与黑胡桃链霉菌ATCC27451做接合转移实验,即供体菌与受体菌混合后涂布于MS平板,并加盖安普霉素至终浓度为50μg/ml Am .28℃培养5 d后得到阳性接合子。挑取阳性接合转移子mLMX-3-49置于37℃培养,使质粒与基因组整合。通过结合转移和同源重组,构建得到氨基甲基化酶编码基因被中断的重组菌株mLMX-3-59.挑选突变株做发酵验证:将基因中断突变株发酵培养,发酵液处理后进行HPLC检测,基因中断突变株mLMX-3-59发酵液中未检测到诺加霉素。基因重组突变株基因型验证结果表明,中断质粒以正确方式整合入基因组,将氨基甲基化酶编码基因中断。发酵验证结果表明,重组菌株发酵产物中不含有诺加霉素。本研究通过同源重组单交换的方法中断SnogA基因,验证该基因在诺加霉素生物合成途径中的作用,检测该基因的失活对诺加霉素生物合成的影响,研究表明snogA基因在诺加霉素生物合成途径中是必需的。基因中断突变株的发酵产物中没有检测到脱甲基诺加霉素和其它衍生物产生,表明同源重组单交换的方法失活SnogA基因可能影响到与蒽环骨架形成相关酶的表达,或者形成的脱甲基衍生物极不稳定而降解。工作为今后深入研究诺加霉素生物合成基因的功能和组合生物合成改造诺加霉素提供了参考。