拟南芥白化突变体pde191加糖变绿现象机制初步研究

摘要

在拟南芥色素缺失突变体中部分突变体存在加蔗糖变绿现象。PDE191是一个转录终止因子家族的基因，其T-DNA插入突变体pde191呈现白化表型，我们发现pde191在加蔗糖时能够变绿，本研究旨在探索pde191加蔗糖变绿的机制。PDE191参与调控rpoA的转录终止。通过real-timePCR比较了变绿与未变绿的pde191中rpoA的转录终止情况，结果显示两者的转录终止效率未发生明显变化。为探讨糖在变绿过程中的作用，我们用蔗糖类似物帕拉金糖代替蔗糖培养pde191，结果显示pde191突变体不能变绿;另外我们添加蔗糖并同时添加蔗糖信号抑制剂KNO3培养pde191，pde191仍然能够变绿，显示糖信号抑制剂不能抑制突变体变绿。该结果初步显示pde191变绿需要蔗糖进入代谢途径。为进一步证实上述结论，我们用糖酵解终产物丙酮酸代替蔗糖，结果显示丙酮酸在一定条件下可以使白化pde191变绿，另一方面，我们同时添加蔗糖和糖酵解抑制剂2-脱氧-D葡萄糖培育pde191突变体，pde191不能变绿。该结果进一步说明pde191变绿需要糖进入代谢过程。由于质体编码的RNA聚合酶(Plastid-encodedpolymerase，PEP)对叶绿体发育起关键作用，我们比较了pde191在不加蔗糖和加蔗糖条件下培养时，其PEP-依赖基因的转录本的积累水平随时间的变化趋势，结果显示加蔗糖变绿pde191中PEP依赖基因转录本积累高于不加蔗糖培养的pde191，尤其在生长7d之后更加明显。我们进一步对比了PEP-依赖基因在可以变绿和不可以变绿的多个色素缺失突变体中其转录本的积累程度，结果显示可以变绿的突变体中PEP-依赖基因的转录本的积累程度整体高于不变绿的突变体中的积累程度。这就说明一定本底水平的PEP活性对变绿有重要作用。我们进一步检测了核酮糖1，5二磷酸羧化酶(Rubisco)大小亚基rbcL、rbcS在蛋白水平上随时间的积累变化，结果显示加蔗糖后pde191中rbcL、rbcS随时间呈现从低到高的积累趋势。总之，我们认为变绿过程需要糖进入代谢途径产生能量，供给叶绿体，维持叶绿体PEP的部分活性，最终pde191能够持续发育并缓慢变绿。

目录

摘要

1 引言

1．1 叶绿体相关背景

1．1．1 叶绿体起源与进化

1．1．2 叶绿体的形态结构

1．1．3 叶绿体的发育

1．1．4 叶绿体基因组

1．1．5 叶绿体研究的主要策略

1．1．6 拟南芥叶色突变基因的克隆

1．2 mTERF(线粒体转录终止因子)蛋白家族

1．2．1 mTERF蛋白家族的结构特征及分类

1．2．2 mTERF蛋白家族的功能

1．2．3 mTERF蛋白家族在动物中的研究进展

1．2．4 mTERF蛋白在拟南芥中的分子功能

1．3 黄化问题相关研究

2．材料与方法

2．1 材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株质粒酶和试剂各种仪器

2．2 培养基和试剂配方

2．3 实验方法

2．3．1 材料收集

2．3．2 转移培养条件

2．3．3 Trizol法提取RNA

2．3．4 RNA反转录成cDNA

2．3．5 real-time PCR检测转录本含量

2．3．6 拟南芥总蛋白提取

2．3．7 Western Blot实验

3 结果与分析

3．1 pde191是苗期白化致死突变体

3．2 培养在2％加蔗糖培养基上pde191植株可以在苗期变绿

3．3 加蔗糖不影响pde191中rpoA的转录终止

3．4 pde191变绿需要外加蔗糖进入代谢过程

3．5 pde191在加蔗糖和不加蔗糖条件下其PEP-依赖基因的转录本积累水平随时间变化趋势

3．6 pde191含有一定水平的本底PEP活性

3．7 变绿过程中叶绿体内部多种蛋白成分的积累变化情况

3．7．1 PEP聚合酶核心亚基rpoA蛋白积累分析

3．7．2 Rubisco大小亚基rbcL和rbcS蛋白含量检测

3．7．3 检测加蔗糖对叶绿体类囊体蛋白复合物亚基积累情况的影响

4．讨论

4．1 能量在变绿过程中的作用

4．1．1 加蔗糖培养时pde191突变体中叶绿体在缓慢的发育

4．1．2 pde191突变体中叶绿体的缓慢发育需要具有一定活性水平的PEP聚合酶的支持

4．1．3 加蔗糖培养pde191突变体时，外源蔗糖提供能量维持PEP聚合酶持续发挥活性

4．2 变绿与信号的关系

4．2．1 变绿过程可以协同核质基因组并且不需要复合物完美的构建完成

4．2．2 关于变绿过程信号问题的探讨

4．2．3 关于变绿过程的进一步的讨论

参考文献

致谢

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