免疫层析快速检测呋喃唑酮代谢物的方法研究

摘要

免疫层析试纸条具有特异性强、灵敏度高、方法简捷、分析容量大、检测成本低等优点，定性检测不需要仪器辅助，且样品前处理步骤简单方便，非常适合现场检测，并且可以提供系列化的产品以及技术产品可以商业化，不仅为检测行业提供帮助，并能为社会创造经济价值。
　　本课题研究设计了两种免疫层析快速检测试纸条，分别用金磁复合微粒和CdTe量子点代替胶体金标记AOZ单抗，结合了纳米标记技术与免疫层析技术，通过金磁微球标记和CdTe QDs荧光标记抗体，与同等胶体金标记相比，提高了灵敏度，在定性分析中，前者可直接通过裸眼判断，后者通过便携式紫外灯照射，在定量分析中，前者可通过磁性号分析仪，后者通过荧光读数仪可分别读取层析载体上三维的磁性号和荧光信号，直接得到信号值，通过建立标准曲线，定量检测值。
　　本课题中制备了粒径均一、分散性好的多层金磁复合微粒，并成功与AOZ单克隆抗体进行偶联，探索到最佳偶联条件为:pH为7.4的环境下，1mg金磁复合微粒表面偶联AOZ-McAb的最佳含量为170μg，投入抗体含量480μg，偶联率为35.43％，用含5％BSA，pH=7.4的Pbs的封闭剂封闭50min，最后探针保存于含0.2％BSA、2％蔗糖、0.8％Triton-Ⅹ-100、0.05％PVP、0.2％Tween-20、0.02％NaN3的Pbs中。可为其他抗体的磁微粒标记提供参考。并对层析垫上材料进行了优选，包括硝酸纤维素膜、样品垫和结合垫，分别选用Satorius CN140、GL-b02、Ahlstrom8964;并对样品垫及结合垫处理液进行了探究实验，分别将含0.5％BSA、2％曲拉通、0.2％NaCl、2％PVP的超纯水溶液作为最佳样品垫处理液及含1％蔗糖、0.2％曲拉通、0.2％Tween-20的超纯水溶液作为最佳结合垫处理液;将以上所得物成功组装成AOZ金磁免疫层析试纸条，并对该试纸条的性能进行了评估，该试纸条灵敏度为8ng/mL，与硝基呋喃类代谢物无交叉反应，特异性较好、重复性佳，常温保存一年，4℃可保存长达2年，稳定性优良。
　　本课题中制备了粒径均一、分散性好，量子产率高达42.3％的高量子产率荧光CdTe QDs，具有良好的光谱性能的可作为标记抗体的优良荧光材料;优选了量子点溶液的纯化方案，即丙酮沉淀法优于透析纯化，对量子点的处理具有较高的参考价值;对荧光探针的偶联条件进行了优化，选择反应50min作为CdTe-AOZ-McAb探针的最佳偶联时间及AOZ-McAb最佳使用量为QDs与AOZ-McAb之比为1∶0.75。得到具有优良光谱性能的荧光探针，为其他荧光材料标记抗体提供可行性偶联方法参考;对层析垫上材料进行了优选，包括硝酸纤维素膜、样品垫和结合垫，分别选用Millipore135、GL-b02、Ahlstrom8964。在以上条件下成功制得AOZ荧光免疫层析试纸条，并对该试纸条的性能进行了评估，灵敏度为5ng/mL，与硝基呋喃类代谢物没有交叉反应，特异性较好、重复性及稳定性优良。
　　作为以上两种试纸条的对比，本研究制备了AOZ金标试纸条。采用最佳试纸条材料及处理方法处理后组装成AOZ金标试纸条，灵敏度为10ng/mL，性能检测优良。通过该试纸条的制作，进一步证明了本研究的磁性试纸条和荧光试纸条具有灵敏度高的优点，通过仪器辅助后试纸条的灵敏度可增加1-2个数量级，远远超过市场上已有产品的检测限，不仅可弥补金标试纸条的缺陷，也为新型试纸条的研制奠定基础，具有较大的研究意义和开发价值。

目录

摘要

主要符号表

第1章 绪论

1．1 呋喃唑酮及其代谢物的的理化性质

1．2 呋喃唑酮对食品的污染及残留限量

1．3 呋喃唑酮残留检测方法

1．3．1 高效液相色谱法

1．3．2 液质联用技术

1．3．3 免疫分析法

1．4 免疫层析技术

1．4．1 免疫层析相关纳米粒子

1．4．2 基于纳米粒子的检测

1．4．3 胶体金免疫层析技术

1．5 磁性免疫层析技术

1．6 荧光免疫层析技术

1．6．1 荧光量子点应用研究进展

1．6．2 作为生物探针的量子点

1．6．3 量子点免疫检测技术

1．7 本课题的研究目的和主要内容

1．7．1 研究目的

1．7．2 主要内容

第2章 AOZ金磁免疫层析试纸条

2．1 实验材料与仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 多层复合金磁纳米颗粒(Fe3O4／Au)的制备

2．2．2 金磁-AOZ-McAb探针的制备及条件的优化

2．2．3 AOZ金磁免疫层析试纸条的组装及组装材料优选

2．2．4 AOZ的衍生化

2．2．5 AOZ金磁免疫层析试纸条的性能评价

2．3 实验结果与分析

2．3．1 多层复合金磁纳米颗粒(Fe3O4／Au)的鉴定

2．3．2 金磁-AOZ-McAb探针制备的条件优化

2．3．3 AOZ金磁免疫层析试纸条的组装

2．3．4 AOZ金磁免疫层析试纸条的性能评价

2．4 本章小结

第3章 AOZ荧光免疫层析试纸条

3．1 实验材料与仪器

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 CdTe荧光量子点的制备及纯化

3．2．2 CdTe-AOZ-McAb探针的制备及偶联条件优化

3．2．3 AOZ荧光试纸条性能测试

3．2．4 AOZ金标试纸条的研制

3．3 实验结果与分析

3．3．1 CdTe荧光量子点的鉴定

3．3．3 CdTe-AOZ-McAb探针的制备

3．3．4 AOZ荧光免疫层析试纸条的组装及组装条件优化

3．3．5 AOZ荧光试纸条性能测试

3．3．6 AOZ金标试纸条的研制

3．4 本章小结

第4章 总结与展望

参考文献

攻读硕士期间的研究成果

致谢

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