辐照致弱捻转血矛线虫三期幼虫凋亡坏死的细胞与分子基础的初步研究

摘要

捻转血矛线虫属毛圆科血矛属线虫，是山羊等反刍动物的主要胃肠道寄生虫之一，动物感染后会出现贫血、消瘦甚至死亡的现象，给牧户带来巨大经济损失。目前的主要防治方法是使用化学药物驱虫，但随着抗药性虫株的的出现，化学药品治疗作用正在逐渐减弱。因此，免疫预防，尤其是分子疫苗的研发，受到研究者们的重视，但迄今为止仍没有研制出一种能够应用于现场的高保护性的分子疫苗。应用X-射线和紫外线照捻转血矛线虫三期幼虫免疫确实能得到较高的保护性效果，而正常的幼虫感染宿主不能诱导较高的抗再感染效果，推测可能是辐照致弱捻转血矛线虫来源的细胞或分子具有较好的免疫原性特征，而正常幼虫则具有耐受原性特征。另外，近年来在抗肿瘤免疫研究中也发现，经光辐照疗法和药物处理的肿瘤细胞免疫动物后，也能获得较高水平的抗肿瘤效果，其机制可能是经处理的肿瘤细胞启动了免疫原性细胞死亡程序，触发了特异的信号和效应分子(如应激分子钙网织蛋白Hc-CRT和HSP70以及ATP分子的暴露和释放），与宿主先天免疫细胞作用，最终诱导了抗肿瘤的免疫应答。因此，我们推测辐照致弱捻转血矛线虫三期幼虫有可能出现免疫原性细胞死亡（坏死性凋亡），能够刺激宿主的保护性免疫应答，而正常线虫幼虫细胞以凋亡为主，主要诱导宿主的免疫耐受。这一假说是否成立，仍有待我们实验证实。为此，本研究在细胞和分子水平上对辐照和正常幼虫的坏死和凋亡变化情况进行了比较分析，并初步研究了应激分子Hc-CRT和HSP70的免疫生物学功能。旨在为进一步阐明辐照致弱幼虫免疫原性细胞死亡的机制提供依据。 首先，比较分析辐照和正常幼虫/细胞的凋亡和坏死的变化情况。收集体外培养的正常组与辐照组0天(2h)，2天，5天，10天，13天的虫体后，胰酶消化成细胞,收集细胞及培养上清后，流式检测不同时期的L3期虫体细胞坏死凋亡情况。结果发现，正常组的细胞（早期和晚期）凋亡的比例在2天时达到最大，随后迅速降低；而辐照组的细胞（早期和晚期）凋亡的比例则在5天时达到最大，随后逐渐下降。并且与正常组的相比，在上述不同的时间点辐照组的细胞早期凋亡比例皆显著大于正常组的；而辐照组的细胞晚期凋亡比例在体外培养后期（5天、10天和13天）明显大于正常组的。检测上清ATP（细胞坏死性凋亡特征分子之一）表达量，结果表明随着培养时间的延长，正常组ATP的含量逐渐下降；而辐照组的ATP含量存在较大的升降波动。但与正常组的相比，辐照组的ATP含量在上述各时间点皆高于正常组的，特别是在第2d和第10d差异非常显著。结果表明辐照组幼虫呈现明显的坏死性凋亡的特征，而正常组幼虫具有常规凋亡特性。 其次，运用免疫组化技术，对Hc-CRT和Hc-HSP70在辐照组和正常组捻转血矛线虫幼虫中的表达特征进行比较研究。结果表明，除表皮等无细胞部位外， Hc-CRT主要集中在肠道、肌肉中，其表达差异主要集中于中间时期，辐照组2天时CRT表达量高于正常组，而在5天、10天、13天表达量均低于正常组。HSP70主要分布于虫体皮下组织及肠道内，HSP70在两组虫体上表达量随培养时间延长，先升高后降低。辐照组除5天时低于正常组外，0天、2天、13天、16时HSP70表达量均高于正常组。提示源于辐照捻转血矛线虫幼虫的应激分子Hc-CRT和Hc-HSP70的表达分布具有坏死性/免疫原性细胞凋亡的特征. 最后，应用分子与细胞免疫学技术比较研究Hc-CRT和Hc-HSP70活化羊PBMC的功能。发现Hc-CRT和Hc-Hsp70在体外能刺激羊PBMC细胞增殖；促进羊PBMC的Th1型相关细胞因子的IFN-γ和TNF-β的表达，抑制Th2型相关细胞因子的IL-13和IL-4以及调节性细胞因子IL-17的表达；并促使免疫细胞产生较多的NO。提示Hc-CRT和Hc-HSP70可以促进山羊PBMC的抗炎性免疫应答。 总之，本研究发现辐照捻转血矛线虫三期幼虫细胞呈现出免疫原性细胞死亡的特征；还发现与免疫原性相关的应激分子Hc-CRT和Hc-HSP70具有刺激羊PBMC的抗炎性免疫应答的功能。这为进一步阐明辐照致弱捻转血矛线虫三期幼虫免疫原性细胞死亡的细胞与分子机制奠定了基础。

目录

英文缩略表

第一章 绪论

1.1 捻转血矛线虫生物学概述

1.2 捻转血矛线虫疫苗

1.3 细胞凋亡与坏死

1.4 钙网织蛋白和热休克蛋白概述

1.5山羊外周血淋巴细胞和细胞因子

第二章 辐照致弱捻转血矛线虫三期幼虫细胞的凋亡和坏死研究

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

第三章 Hc-CRT和Hc-HSP70蛋白在辐照和正常捻转血矛线虫幼虫上的表达与分布研究

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4讨论

第四章 Hc-CRT和Hc-HSP70活化羊PBMC免疫功能的研究

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4讨论

第五章 全文总结

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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