厌氧发酵产氢反应器的连续运行及蛋白质组学的研究

摘要

厌氧发酵制氢技术是近几年科学家们关注较多的生物制氢技术，利用此技术将处理高浓度有机废水与产氢有效结合，逐步研发了产氢效率较高，运行稳定，并能适用于工业化生产的厌氧发酵制氢反应器。开展厌氧发酵制氢反应器与产氢细菌蛋白质组学研究为进一步提高厌氧发酵制氢反应器的产氢效率提供重要信息和技术支持。 本研究通过连续流搅拌槽式反应器(CSTR)的连续运行处理高浓度糖蜜废水，通过对工程参数的控制维持反应器的稳定运行，并对活性污泥进行驯化。采用Illumina MiSeq平台高通量测序技术对比分析了启动运行不同阶段的优势菌群组成，筛选到高效产氢菌株，进而采用基于iTRAQ标记的定量蛋白质组学技术，分析了该菌株在产氢过程中的丰度差异蛋白质。 结果表明，不同起始污泥负荷的两次CSTR的启动运行均较好地完成了活性污泥的驯化。两次CSTR反应器运行的出水pH值均稳定在4.7～4.9，经过驯化后的活性污泥具有良好的沉降性能。两次反应器运行的液相发酵产物总量分别为1，298mg·L-1和1，934mg·L-1，其中乙酸和丁酸质量浓度占发酵产物总质量的73.1％和70.8％，因此两次CSTR反应器启动运行均为丁酸型发酵。活性污泥优势菌群分析表明，两次CSTR反应器的启动运行通过对活性污泥的驯化分别形成了以产乙醇杆菌属（Ethanoligenes）、巨球型菌属（Megasphaera）和Ⅳ型梭菌（ClostridiumⅣ）为主的优势菌群组成和以巨球型菌属(Megasphaera)、产乙醇杆菌属（Ethanoligenens）为主的优势菌群组成。经过两次CSTR反应器启动运行对活性污泥的驯化，与产氢功能相关的菌种均占污泥中微生物总量的40％以上。这表明CSTR反应器较好的完成了两次启动运行，并达到污泥驯化的目的，通过分离筛和获得目标菌种。 对驯化后的活性污泥进行分离筛选，初步筛选出产氢能力较高菌种共8株，进一步进行间歇产氢实验，菌株WJY-29产氢能力最高，累计产气量和累计产氢量，分别为3，464mL/L-culture和2，004mL/L-culture，16SrDNA分析表明，菌株WJY-29与拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii NRRL B-598）基因序列同源性达99％。 选取pH为6.5的培养基条件，培养时间分别为10h、15h和30h的拜氏梭菌进行了基于iTRAQ标记的定量蛋白质组学分析。经过三次生物学重复鉴定到757种可信差异蛋白质，其中378种蛋白质丰度上升，339种蛋白质丰度下降。糖酵解过程中的6-磷酸葡萄糖异构酶、烯醇化酶（磷酸丙酮酸水合酶）、醛脱氢酶，以及果糖二磷酸醛缩酶在拜氏梭菌WJY-29不同培养时间下蛋白质丰度明显上升。这表明拜氏梭菌WJY-29通过糖酵解途径分解葡萄糖。此外，铁氧还蛋白[FeFe]-氢化酶、甲酸脱氢酶、丙酮酸黄素氧化还原酶在拜氏梭菌WJY-29不同培养时间下蛋白质丰度上升显著。由此可推断拜氏梭菌WJY-29的产氢途径为，在严格厌氧的培养基中，拜氏梭菌WJY-29酵解葡萄糖，将葡萄糖分解成丙酮酸，在丙酮酸脱氢酶的作用下丙酮酸脱羧，羟乙基与酶的焦磷酸硫胺素结合，然后生成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A进一步脱氢，还原铁氧还蛋白，进而在氢化酶的作用下，铁氧还蛋白被铁氧还蛋白氢化酶重新氧化并释放出H2。

目录

摘要

1．1引言

1．2厌氧发酵制氢

1．2．1乙醇型发酵

1．2．2丙酸型发酵

1．2．3混合酸型发酵

1．2．4丁酸型发酵

1．3厌氧发酵反应器的启动运行及活性污泥菌群结构

1．4产氢菌的筛选及培养基的优化

1．5产氢菌蛋白质组学

1．5．1产氢菌代谢途径中相关酶蛋白质研究进展

1．6课题背景

1．6．1课题目的及意义

1．6．2课题主要研究内容

第2章实验材料与方法

2．1 CSTR厌氧发酵制氢反应器的实验装置与材料

2．1．1 CSTR反应器启动运行实验装置

2．1．2接种污泥

2．1．3实验底物

2．2实验仪器

2．3反应器运行的工程参数测定

2．3．1 COD的测定

2．3．2 pH的测定

2．3．3液相发酵产物的测定

2．3．4活性污泥沉降体积的测定

2．3．5活性污泥形态观察

2．3．6 CSTR反应器产气量和产氢量的测定

2．4活性污泥微生物群落组成测定

2．5产氢菌的分离和筛选

2．5．1样品的采集及分离纯化

2．5．2菌种筛选

2．5．3菌种培养方法

2．5．4菌种保存

2．6菌种鉴定

2．6．1菌种形态观察

2．6．2菌种电镜扫描观察

2．6．3菌种染色鉴定

2．6．4最适初始pH值条件试验

2．6．5产氢菌种的分子生物学鉴定

2．7间歇实验装置与材料

2．7．1间歇实验菌种

2．7．2间歇实验装置

2．7．3间歇实验药品及培养基含量

2．7．4气体及氢气含量测定

2．7．5比产氢率的计算

2．8产氢菌蛋白质组学分析

2．8．1实验药品

2．8．2产氢菌蛋白质样品制备

2．8．4 Trypsin酶切蛋白质样品

2．8．5 iTRAQ试剂标记多肽样品

2．8．7蛋白质数据库搜索与定量分析

2．8．8筛选可信定量结果及数据分析

2．8．9产氢菌蛋白质功能分类

第3章CSTR厌氧发酵制氢反应器的启动运行

3．1 CSTR反应器的启动运行

3．1．1活性污泥显微镜下观察结果

3．2 CSTR反应器的第一次启动运行

3．2．1反应器启动运行参数控制

3．2．2第一次运行阶段pH值的变化

3．2．3第一次运行阶段COD的变化

3．2．4液相发酵产物含量分析

3．2．5反应器启动运行期间产气量和产氢量的测定

3．2．6活性污泥沉降体积分析

3．2．7水力停留时间对COD去除率的影响

3．3 CSTR反应器的第二次启动运行

3．3．1反应器启动运行参数控制

3．3．2第二次运行阶段pH值的变化

3．3．3第二次运行阶段COD的变化

3．3．4液相发酵产物含量分析

3．4 CSTR反应器中活性污泥群落特征分析

3．4．1第一次CSTR反应器中活性污泥微生物群落特征分析

3．4．2第二次运行阶段活性污泥微生物群落特征分析

3．4．3两次CSTR反应器启动运行活性污泥微生物群落特征差异分析

3．5本章小结

第4章产氢菌种的分离和筛选

4．1产氢菌的分离和筛选

4．2产氢菌的菌种鉴定

4．3产氢菌WJY-29的形态特征

4．4产氢菌WJY-29的生理生化特性

4．5产氢菌WJY-29的间歇性实验

4．5．1初始pH值对产氢菌WJY-29产气量和产氢量影响

4．6本章小结

第5章拜氏梭菌WJY-29产氢途径蛋白质组学分析

5．1研究对象选择

5．2不同培养时间下产氢菌WJY-29差异表达蛋白质分析

5．2．1差异表达蛋白质功能分类

5．2．2差异表达蛋白质丰度变化

5．2．3产氢相关差异蛋白质聚类分析

5．3参与糖酵解途径的蛋白质

5．4参与细菌产氢代谢途径蛋白质

5．4．1丙酮酸脱羧相关蛋白质

5．4．2 NADH／NAD+与产氢调节相关的蛋白质

5．5拜氏梭菌WJY-29厌氧发酵代谢途径推断

5．6本章小结

第6章结论

参考文献

附录

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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