靶向铜绿假单胞菌PcrV与Alginate的scFv--Fc抗体分子制备及体外活性研究

摘要

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是临床上最主要的超级细菌种类之一，对常用抗生素都表现出很强的耐药性，且其能够通过多种机制获得耐药性，例如形成生物膜之后抗生素难以进入生物膜，使得耐药性增强，或通过Ⅲ型分泌系统侵入细胞成为胞内菌，抗生素难以进入细胞从而难以被杀灭。鉴于铜绿假单胞菌在抗生素治疗中存在的固有耐药，以及形成生物膜与胞内菌后使得耐药性增强等原因，传统的抗生素治疗越来越难以控制铜绿假单胞菌感染，因此亟需开发新型的治疗方式。抗体药物具有特异性强、安全性高等特性，在抗细菌感染方面具有独特优势，因此近年来开始获得重视。本研究通过选取铜绿假单胞菌PcrV与Alginate两个靶点，制备单链可变区融合重链恒定区(ScFv-Fc)形式的抗体MFa（抗PcrV）与MFb（抗Alginate），并分析其亲和活性，进而研究其体外对铜绿假单胞菌生物膜形成、黏附细胞、侵入细胞的影响，为进一步开发抗铜绿假单胞菌感染的新型抗体药物提供研究基础。 本研究首先将编码MFa及MFb的DNA序列分别合成后，插入到真核表达载体中，获得重组质粒，再通过聚乙烯亚胺(PEI)在HEK293E细胞中获得瞬时转染及表达;表达的产物通过HiTrap MabSelect SuRe柱进行纯化，所得到的抗体通过SDS-PAGE分析纯度以及BCA法测定蛋白含量。为了研究抗体与抗原的亲和活性，对抗原PcrV与Alginate进行制备。其中PcrV抗原选用pET28a质粒作为载体，将PcrV目的序列插入到pET28a中构建重组质粒，进而转化到E.coli BL21(DE3)中，在15℃，0.5mM IPTG的条件下进行低温诱导表达，通过与PcrV融合表达的His-Tag标签进行亲和纯化，并通过SDS-PAGE、BCA、HPLC对纯化的PcrV进行纯度及含量的分析;Alginate通过EDC作用与BSA进行偶联以开发针对MFb的Western blot及ELISA等检测方法。对纯化后的抗体通过Western blot、ELISA、表面等离子共振(SPR)检测其与抗原的亲和活性。 进一步对所制备的抗体MFa及MFb进行体外对铜绿假单胞菌的活性研究，主要分以下几个方面:MFa及MFb抗体对生物膜形成的影响、对已形成的生物膜的破坏作用、对铜绿假单胞菌黏附HeLa细胞影响、对铜绿假单胞菌侵入HeLa细胞的影响，以及对巨噬细胞吞噬铜绿假单胞茵的影响。 本研究获得以下结果: 一、成功制备了抗铜绿假单胞菌PcrV与Alginate的抗体MFa及MFb。亲和力实验表明，MFa与PcrV抗原的亲和常数KD为492.2nM，MFb与Alginate抗原的亲和常数KD为8.308nM。 二、抗体的体外生物学活性表明MFa与MFb均能够降低铜绿假单胞菌生物膜的形成，降低铜绿假单胞菌对HeLa细胞的黏附作用，并能够降低铜绿假单胞菌对HeLa细胞的侵入作用，同时MFa与MFb单独使用均能够增加巨噬细胞对铜绿假单胞菌的吞噬作用。 综上，本研究制备了靶向铜绿假单胞菌的scFv-Fv形式的抗体药物分子MFa及MFb，它们分别靶向PcrV蛋白及Alginate，体外生物学活性分析表明两个抗体均能够在一定程度上作用于生物膜形成，降低胞内寄生菌的形成，增强巨噬细胞的吞噬作用，提示其具有对铜绿假单胞菌引起的感染的潜在效用，具有进一步开发为抗铜绿假单胞菌治疗药物的价值。

目录

摘要

缩略词

第一章绪论

1．1铜绿假单胞菌的研究进展

1．1．1铜绿假单胞菌及其耐药机制

1．1．2铜绿假单胞菌黏附与生物膜形成

1．1．3铜绿假单胞菌侵入细胞形成胞内菌

1．1．4巨噬细胞在铜绿假单胞菌感染中的作用

1．2抗体药物研究进展

1．2．1抗体药物简介

1．2．2抗体药物抗菌方面的研究进展

1．2．3 PcrV抗体的研究进展

1．2．4 Alginate抗体的研究进展

1．3立题依据

1．4主要研究内容

第二章MFa、MFb抗体的表达及亲和活性研究

2．1实验材料

2．1．1实验仪器与耗材

2．1．3实验试剂及配置

2．2实验方法

2．2．1 MFa、MFb抗体结构及质粒构建

2．2．2 MFa、MFb质粒抽提及验证

2．2．3细胞培养及MFa、MFb质粒的瞬时表达

2．2．4 MFa、MFb抗体亲和色谱纯化

2．2．5 PcrV质粒构建及转化

2．2．6 PcrV抗原表达及条件优化

2．2．7 PcrV抗原亲和色谱纯化

2．2．8 Alginate-BSA偶联

2．2．9 SDS-PAGE与Western blot检测

2．2．10 BCA法测蛋白浓度

2．2．11 ELISA检测抗体抗原的亲和力

2．2．12 HPLC法检测蛋白纯度

2．2．13 SPR检测抗体与抗原的分子动力学参数

2．3结果与讨论

2．3．2 MFa、MFb质粒转染HEK293E细胞

2．3．3 MFa、MFb抗体的纯化

2．3．4 MFa、MFb抗体纯化后SDS-PAGE

2．3．5 PcrV质粒构建、转化及抗原表达条件优化

2．3．6 PcrV抗原纯化

2．3．7 PcrV抗原纯化后SDS-PAGE、BCA测定、HPLC

2．3．8 PcrV抗原His标签验证

2．3．9 Western blot检测抗体与抗原亲和力

2．3．10 ELISA检测抗体抗原的亲和力

2．3．11 SPR检测抗体与抗原的分子动力学参数

2．4本章小结

第三章抗体的体外活性研究

3．1实验材料

3．1．1实验仪器

3．1．1实验试剂

3．2实验方法

3．2．1抗体对细菌生物膜形成的影响

3．2．2抗体对已形成的细菌生物膜的破坏作用

3．2．3抗体对铜绿假单胞菌黏附HeLa细胞的影响

3．2．4抗体对铜绿假单胞菌侵入HeLa细胞的影响

3．2．3抗体对巨噬细胞吞噬铜绿假单胞菌的影响

3．3实验结果

3．3．1抗体对细菌生物膜形成的影响

3．3．2抗体对铜绿假单胞菌生物膜破坏的影响

3．3．3抗体对铜绿假单胞菌黏附HeLa细胞的影响

3．3．4抗体对铜绿假单胞菌侵入HeLa细胞的影响

3．3．5抗体对巨噬细胞吞噬铜绿假单胞菌的影响

3．4本章小结

第四章全文总结与展望

4．1全文总结

4．2展望

参考文献

攻读硕士学位期间的成果

附录

致谢

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