水稻DEAD--box RNA解旋酶蛋白基因TCD33功能研究

摘要

DEAD-box RNA解旋酶存在于大多数生物中，它参与RNA多方面代谢，对植物生长发育尤其在非生物胁迫应答中发挥重要作用。本研究通过对粳稻品种嘉花1号60Coγ射线诱变处理获得的一个低温敏感白化突变体tcd33，通过对其进行性状特征分析、图位克隆、基因互补、亚细胞定位及相关功能分析得出以下结论: 1.在低温20℃环境下，tcd33从发芽到长至四叶期时均表现为白化表型，并最终死亡，而在高温32℃环境下tcd33的表型与野生型嘉花1号相比没有明显差异。 2.在20℃条件下生长的tcd33幼苗中的光合色素叶绿素a(Chla)和叶绿素b(Chlb)以及类胡萝卜素(Car)几乎检测不到，而在32℃环境下WT和tcd33之间的色素水平仅有轻微差异。通过透射电镜观察发现野生型的叶绿体结构在任何温度下都非常完整。然而在20℃时，tcd33突变体中几乎观察不到完整叶绿体，并且有大量气泡结构，但在32℃时与野生型没有明显差异。 3.对培矮64S与tcd33杂交得到的F2代群体进行遗传分析发现其表型分离比为3（绿色）∶1（白色），表明tcd33突变体性状受单个隐性核基因控制。 4.利用图位克隆技术把突变基因TCD33定位在三号染色体的InDel分子标记ID00216和SSR分子标记MM0093之间的一个51kb的区域内。对该区间范围内的所有候选基因进行测序分析发现只有编码DEAD-box RNA解旋酶的LOC_Os03g01830（TCD33）基因第三外显子上有七个碱基的缺失(TTCTCAG)，导致移码突变，翻译提前终止。开展基因互补实验验证图位克隆结果。亚细胞定位显示该基因主要在叶绿体中发挥作用。 5.通过对TCD33所编码的氨基酸序列进行同源序列比对和进化树分析，发现其在不同高等植物中具有较高的保守性，与单子叶植物的亲缘关系较近，与双子叶植物亲缘关系较远。 6.对叶绿素合成、光合作用、叶绿体发育相关基因进行qPCR分析，结果显示TCD33基因影响水稻叶绿体核糖体的发育及叶绿体发育全过程。 本研究报道了一个水稻温敏感的DEAD-boxRNA解旋酶基因TCD33，对该基因进行初步分析，为以后研究水稻低温胁迫下叶绿体发育和光合作用代谢调控提供新思路。

目录

摘要

第1章文献综述

1．3 DEAD-box RNA解旋酶的功能

1．3．1 DAED-box蛋白在转录过程中的作用

1．3．2前体mRNA的剪接

1．3．3参与核糖体结构的形成

1．3．4参与RNA转运

1．3．5参与翻译起始阶段

1．3．6参与RNA衰变

1．4 DEAD-box RNA解旋酶参与植物生长发育

1．5．1植物DEAD-box RNA解旋酶参与低温胁迫应答

1．5．2植物DEAD-box RNA解旋酶参与热胁迫应答

1．5．3植物DEAD-box RNA解旋酶参与盐胁迫应答

1．5．5植物DEAD-box RNA解旋酶参与植物氧化胁迫应答

1．6水稻叶绿体的发育机制及温敏感叶色突变体的研究概况

1．6．1水稻叶色突变体来源及发生机制

1．6．2温敏感叶色突变体的表型及分类

第2章材料与方法

2．1实验材料

2．2实验方法

2．2．1苗期叶色表型调查

2．2．2野生型和tcd33光合色素测量

2．2．3叶绿体亚显微结构观察

2．2．4建立遗传分析库

2．2．5 tcd33亲本与突变体DNA提取

2．2．6 tcd33的基因定位与图位克隆

2．2．7候选基因的功能分析与测序和突变基因的发现

2．2．8突变体tcd33突变基因的互补验证

2．2．10 CRISPR／Cas9基因组编辑技术

2．2．11 TCD33的组织特异性表达分析

2．2．12 TCD33亚细胞定位分析

2．2．13 TCD33编码蛋白的生物信息学分析

2．2．14突变体及互补苗叶绿体发育和叶绿素合成相关基因qPCR分析

第3章结果与分析

3．1 tcd33苗期性状特征分析

3．1．1 tcd33苗期叶色表型

3．1．2突变体tcd33光合色素含量测定

3．2 tcd33叶绿体亚显微结构

3．3遗传分析

3．4图位克隆

3．5 TCD33互补实验结果

3．6 TCD33的CRISPR／Cas9敲除实验

3．7 TCD33组织特异性表达

3．8温度对TCD33表达影响

3．9 TCD33基因的亚细胞定位分析

3．9 TCD33编码的蛋白结构特征分析

3．10参与叶绿体成熟、光反应及色素合成基因的转录水平分析

第4章讨论与分析

4．2TCD33参与叶绿体核糖体的组装

4．3 TCD33参与低温胁迫应答

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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