人白细胞介素４在衣藻叶绿体中的高效转化及表达

摘要

叶绿体转化是近些年发展起来的一项环境友好的基因工程技术，由于叶绿体基因组的高度多倍性，叶绿体转化允许每个细胞中导入近百到数千个拷贝的外源基因，并表达较高水平的外源蛋白。近几年来，尽管高等植物叶绿体表达系统也成功地高表达了数种蛋白质药物，如人生长激素、人血清白蛋白、人胰岛素、口服疫苗等，但由于植物叶绿体转化及转基因植物再生障碍、以及植物代谢产物复杂而不利于提取纯化等问题，使得该项技术的应用受到限制。因此，人们把研究的目标转向莱茵哈德衣藻的叶绿体转化系统。 本文利用PCR融合技术将人白细胞介素4基因(hIL4)融合到莱茵哈德衣藻叶绿体基因组rbcL 5’-UTR和3’-UTR非翻译区序列之间，得到了5’UTR-hIL4-3’UTR融合表达单元；然后将其插入到来源于莱茵哈德衣藻叶绿体基因组5.7Kb的同源片段中，构建成pXhIL4同源重组交换质粒；利用电脉冲法将pXhIL4质粒与含有aadA基因的壮观霉素抗性质粒p228共同转化莱茵哈德衣藻叶绿体。 本实验研究了莱茵哈德衣藻的生长条件、生理特性以及在电脉冲转化中所需的化学、物理参数及其与转化效率的相关性，并进行转化子筛选与检测，初步探讨了外源基因在莱茵哈德衣藻叶绿体中的同质化进程。从含有100ug/ml的壮观霉素抗性平皿上筛选到阳性藻落，并通过PCR扩增方法检测到hIL4基因，检测结果显示，其共转化频率高达90％。经过Western blotting印迹转移分析，证实了人白细胞介素4基因在转基因莱茵哈德衣藻藻株中成功获得表达。 本文建立的电脉冲转化的方法是一种简单、方便、高效的莱茵哈德衣藻叶绿体转化方法，为进一步研究在莱茵哈德衣藻叶绿体中高效表达外源蛋白奠定了基础。