基于苷元特征显色检测苜蓿总皂苷的研究

摘要

本文首先以提取率为考察指标，利用响应面分析优化了提取苜蓿皂苷的工艺条件；以大孔吸附树脂AB-8和阳离子交换树脂联用富集、纯化总皂苷类成分；用制备高效液相色谱法分离出一种皂苷单体并用ESI/MS法分析确证其结构；在此基础上，系统地研究了基于苜蓿皂苷苷元比色法测定苜蓿总皂苷含量的方法。其研究的主要结果如下： 研究和比较了2种不同的TAS提取方法，（1）以乙醇溶液为溶剂，通过对影响萃取效果的单因素分析，建立响应面分析实验，优化提取工艺条件。最佳提取条件为：提取温度45 ℃、提取时间154 min、液料比(ml/ g)=10:1、乙醇浓度63％，提取1次，提取率为78.7％。（2）超声法提取TAS，结果表明：用20 kHz超声波提取60 min，提取率为97.41％。这种方法的提取率与加热搅拌提取2次（合计提取时间240 min）的皂苷提取率基本相等。 脱脂苜蓿根粉的醇提液中含有糖类物质和色素，采用大孔树脂吸附和阳离子交换树脂去除提取液中的杂质物质。实验确定AB-8树脂的吸附条件为：溶液pH为8～9、NaCl浓度为0.80％、苜蓿皂苷溶液的初始浓度以8 mg/ml为宜、上样流速为3 BV/h、洗脱液为95％的乙醇。收集洗脱液并减压蒸干后，溶在15％的甲醇中，然后过阳离子交换柱脱色。TLC鉴定结果表明，纯化后的产品中含有苜蓿皂苷类成分纯度高。 以制备高效液相色谱法从脱脂苜蓿根粉乙醇提取并经过上述分离初步纯化的粗提物中分离出一种皂苷单体，通过ESI/MS分析确证其结构为3-O-[β-D-glucopyranosyl]-28-O-[β-D-xylopyranosyl(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranoside] medicagenate。 建立了利用皂苷元特征显色测定苜蓿皂苷含量的定量方法。以香草醛-高氯酸为显色剂，冰醋酸为溶剂，使皂苷元显色，用分光光度法在波长为560 nm处测定苜蓿皂苷元的含量。以3-O-[β-D-glucopyranosyl]-28 -O-[β-D-xylopyranosyl(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranoside] medicagenate酸水解后的苷元为标样，建立的标准方程为y = 0.0031x，R2 = 0.9993， 该回归曲线高度显著，线性和稳定性可靠。