Bed3基因的克隆、表达及其表达产物Znf-bed3蛋白的纯化和结晶

摘要

Znf-bed3 是一种新发现的蛋白，它具有锌指结构，可以与Axin 相互作用从而正调控Wnt/β-catenin 信号通路。其基因序列已经获得并插入pET28a 质粒得到Δ72a 质粒。为了获得高质量的晶体以确定Znf-bed3 蛋白的结构，将Bed3基因于NdeⅠ和EcoRⅠ位点克隆入pET28c 质粒，在BL21-CodonPlus(DE3)-RP菌株中表达目的蛋白，得到氨基端有组氨酸标签的Znf-bed3 融合蛋白。超表达得到的Znf-bed3 融合蛋白约占全菌蛋白的80％。 由于融合蛋白有组氨酸标签，首先考虑使用镍柱对目的蛋白进行分离纯化，但是分离结果显示此方法对分离目的蛋白有一定的局限性。表达得到的目的蛋白有80％以上以包涵体形式存在，所以希望使用变复性方法处理包涵体以得到高纯度的目的蛋白。传统的盐酸胍变复性实验中，目的蛋白复性效率很低十分低（最高仅能达到10％），不适合用于进行目的蛋白的分离，所以必须探索新的纯化方案。由破菌一步开始进行，使用不同破菌液和变性剂进行破菌和包涵体洗涤条件的优化。实验中发现，30％醋酸破菌液能够很好的溶解包涵体，而且上清中目的蛋白相对纯度较高，只过分子筛便可以得到纯度达到结晶标准的蛋白。30％的醋酸极有可能会使蛋白产生酸变性，为了防止目的蛋白在醋酸溶液中变性而影响结晶过程，引入圆二色法比较此方法获得的目的蛋白和镍柱分离得到的目的蛋白的二级结构，结果显示醋酸液中得到的目的蛋白二级结构与天然结构一致，可以用于进行结晶实验。使用悬滴法对Znf-bed3 蛋白进行结晶实验，在几个条件下获得微晶。