1型糖尿病鼠类模型的肠道菌群分析

摘要

近年来，1型糖尿病及其动物模型的发病机理已经研究得较为透彻，鼠类模型的发病过程被归纳为遗传缺陷主导，环境因素诱发，两者相互作用导致了1型糖尿病的发生。环境因素的研究主要集中于营养物和病毒感染，肠道微生态系统因其内在复杂性而少有涉及。少数相关的文献用分离培养的方法揭示了糖尿病病人和模型动物发生了肠道菌群失调。我们实验室采用分子生态学的方法来研究两者的关系，发现肠道菌群与糖尿病的发生发展存在一定的关系，某些菌可能与糖尿病直接相关。 实验中，我们将同一批ICR小鼠，随机分成两组，一组为糖尿病模型组，另外一组为健康对照组。糖尿病造模采用静脉注射链脲佐菌素（STZ）方法，造模后糖尿病小鼠体重明显轻于对照小鼠，表现出显著糖尿病“三多一少”的症状。保留几只血糖未升高的造模鼠，与造模成功小鼠的作对照。 首先采用ERIC-PCR指纹图谱技术解析各组小鼠的粪便菌群总DNA样品，获得DNA指纹信息，通过PLS-DA（偏最小二乘法区别分析）统计方法寻找各组样品之间的规律性变化，结果发现，对STZ敏感的糖尿病小鼠和对STZ不敏感的小鼠的肠道菌群显著区别于健康对照小鼠的菌群，而STZ易感性小鼠与STZ抵抗型小鼠的菌群仍有一定差别。为了进一步辨别菌群结构的差异和决定此差异的菌种，我们又采用了16S rDNA V3－DGGE方法对样品进行了分析，结果显示，所有空白对照与造模不成功的鼠（低血糖）都有两条较亮的条带，而糖尿病小鼠则较暗。割胶回收DNA，测序结果表明这两种都属于乳杆菌属（Lactobacillus）。因此我们选用乳酸菌种群（LAB）特异性引物扩增所有样品，DGGE的分析结果验证了低血糖组的两条明显的优势带在高血糖组中被显著减弱。经测序分析，这两条带分别代表肠乳酸杆菌（Lactobacillus intestinalis）和罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)。最后，通过V3 DGGE和LAB DGGE图谱的主成分分析分析，对比三组小鼠菌群的条带变化，验证了这两种乳杆菌是导致低血糖和高血糖两类小鼠肠道菌群差别的主要原因，而其他健康相关菌群——拟杆菌、梭菌、双歧杆菌的群落结构未见明显差别。此外，在糖尿病小鼠的试验中，还观察到糖尿病小鼠的双歧杆菌数量明显低于正常小鼠。以上结果表明糖尿病发生后，两种与宿主健康密切相关的肠道细菌群落（双歧杆菌和乳杆菌）分别发生了结构上和数量上的改变。 此后,对糖尿病大鼠的肠道菌群结构的初步分析,表明糖尿病大鼠的乳酸菌种群结构随时间的变化显著与健康对照大鼠的不同，而两者的菌群结构在造模前时间点上没有明显差异。这提示糖尿病的发生和发展是导致肠道菌群结构发生变化的重要影响因素。 本研究中，肠道益生菌的结构数量变化与血糖值的反相关对应关系，与采用分离培养的肠道菌群研究所揭示的结果相类似。这表明糖尿病鼠类发生的肠道菌群失调主要表现为肠道益生菌的减少，因此可能会影响宿主糖尿病的发生和发展，补充益生菌或用药物干预菌群结构可能将成为预防和治疗1型糖尿病的有效途径。