GST-hDSL对人造血干/祖细胞体外扩增的影响

摘要

造血干细胞移植已经成为逐渐增多的白血病、恶性肿瘤和某些遗传性疾病患者的临床治疗选择。造血干细胞来源于骨髓、脐带血及动员后的外周血。但由于来源及可获得的细胞数量有限,限制了临床应用,所以造血干/祖细胞的体外扩增是一个研究热点。Notch信号通路是被广泛应用的,进化高度保守的细胞分化调节系统,在许多发育系统中对细胞的命运决定起着重要的调节作用。Notch通路通过位于细胞表面的受体与配体的结合而激活。一系列的研究证明Notch受体广泛表达于造血干/祖细胞以及成熟的血细胞,Notch配体表达于造血基质细胞,提示Notch通路对造血系统的发生和发育具有调控作用。Notch配体胞外区含有一段在各个配体之间高度保守的结构域,称为DSL结构域(DSL domain),它是配体与受体结合并激活受体所必需的结构域。hDelta-like-1(hDll-1)是人Notch配体之一,通过对hDll-1蛋白结构功能域的研究,我们选出了具有Notch受体激活功能的hDll-1最小功能蛋白序列,包括进化中的DSL保守结构区和与之相邻的N-端的50个氨基酸,命名为hDll-1NDSL(简写：hDSL)。我们实验室将此hDSL序列克隆入原核表达载体pGEX-2T中,在大肠杆菌DH5α中诱导表达并用DEAE阴离子交换柱纯化得到了带有表达谷胱甘肽S转移酶( glutathione-s-transferase, GST)的GST-hDSL融合蛋白。本课题首次将GST-hDSL蛋白用于人脐血造血干/祖细胞的培养,观察GST–hDSL对脐带血造血干/祖细胞扩增的作用。本研究通过免疫磁珠法(MACS)分离纯化脐血CD34~+细胞,然后联合其它的细胞因子研究GST–hDSL对CD34~+造血干/祖细胞扩增的影响。研究的主要结果如下：1)在细胞因子SCF, FL, IL-3, TPO存在时,经过21天的长期液体培养,每隔7天进行一次流式、集落检测并换入新的培养基和细胞因子、蛋白。研究发现造血干细胞扩增的最佳时间为14天；与对照组相比：GST-hDSL对总体细胞的扩增(细胞总数、细胞凋亡率),造血干/祖的扩增(CD34~+细胞数、集落数),向单核系分化均无影响,但可促进CD34~+细胞向粒系的分化；2)在不存在其它细胞因子时,经过14天的培养,研究GST-hDSL蛋白单独作用对造血干/祖细胞的影响。GST-hDSL蛋白的单独作用对总体细胞的扩增(细胞总数),造血干/祖的扩增(CD34~+细胞数、集落数),向单核系分化均无影响；3)在细胞因子SCF, GM-CSF存在时,GST-hDSL蛋白对总体细胞的扩增(细胞总数、细胞凋亡率、分裂期S期细胞),向髓系分化(粒系,单核系)均无影响,但GST-hDSL组的CD34~+细胞数,集落数以及高增值潜能集落数分别是对照组的1.7、1.2、5.3倍。由此可见：1、GST-hDSL对于细胞总数的扩增无影响； 2、GST-hDSL蛋白对人脐血CD34~+造血干/祖细胞的扩增以及分化作用受联合用细胞因子的影响；3、在与细胞因子SCF和GM-CSF联合作用时,GST-hDSL具有显著促进人脐血造血干/祖细胞(CD34~+细胞,集落数以及高增值潜能集落数)扩增的作用。本研究结果为今后用GST-hDSL扩增人造血干细胞奠定了实验基础。

目录

摘要

Abstract

第一章 绪论

1.1 造血干细胞的特性及体外扩增

1.2 Notch 信号通路

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 主要实验仪器及设备

2.1.2 主要试剂和溶液

2.1.3 实验耗材

2.2 方法

2.2.1 GST-hDSL 蛋白的纯化

2.2.2 蛋白浓度的测定

2.2.3 脐血单个核细胞的制备

2.2.4 CD34~+ 细胞的分离纯化

2.2.5 CD34~+ 细胞的液体培养

2.2.6 流式分析

2.2.7 造血干/祖细胞的集落培养实验

2.2.8 统计学分析

第三章 实验结果

3.1 蛋白浓度的测定

3.2 分离、纯化后脐血 CD34~+ 细胞的纯度检测

3.3 第一次实验分组

3.3.1 细胞总数的扩增情况

3.3.2 流式分析

3.3.3 集落计数结果

3.4 第二次实验分组

3.4.1 细胞总数的扩增情况

3.4.2 流式分析

3.4.3 集落计数情况

3.5 第三次分组

3.5.1 细胞总数的扩增情况

3.5.2 流式分析

3.5.3 集落计数情况

第四章 讨论

参考文献

致谢

攻读学位期间完成的论文