小球藻异养培养的动力学分析与优化

摘要

小球藻(Chlorella)是一种单细胞微藻,含有丰富的蛋白质、类胡萝卜素、多糖、维生素和小球藻生长因子等多种营养及活性成份,具有抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力和预防心血管疾病等生理功能.由于富含叶黄素(lutein),小球藻作为一种极具潜力的叶黄素源而受到关注.与其它叶黄素源相比,小球藻具有生长迅速、可进行异养培养等优势.但迄今为止,小球藻的异养培养效率和水平与其它微生物(如酵母等)培养体系相比还有很大的差距.为建立高效的小球藻异养培养系统及叶黄素生产方式,本论文进行了以下方面的研究工作: (1) 通过摇瓶实验对影响小球藻异养生长和叶黄素合成的主要培养参数,包括接种量、通气量及培养基中四种主要成分--葡萄糖、KNO<,3>、KH<,2和MgSO<,4>的浓度进行了研究和优化,并在均匀设计实验的基础上建立了多元回归模型.研究结果表明,充足的通气量是小球藻生长和叶黄素合成的必要条件;葡萄糖浓度和c∶N比是影响小球藻异养生长和叶黄素合成的主要因素,在10-0g/l范围内,较高的葡萄糖起始浓度可提高小球藻的最终生物量和叶黄素产量,但抑制小球藻的生长速度;在2∶1-12∶1范围内,较低的C∶N比有利于提高小球藻细胞中叶黄素含量. (2) 在对小球藻异养生长进行动力学分析的基础上,通过流加方式的优化实现了小球藻的高密度培养.首先基于在 19-1 发酵罐中进行的分批培养实验,构建了描述小球藻异养生长的确定化模型 (deterministicmodel),在该模型的基础上通过采用遗传算法进行了流加方式的初步优化,使小球藻的细胞浓度(以单位体积干重计)和最大生产效率分别达到104.9g/l和0.613 g/l/h.在进行多批流加培养实验的基础上,构建了推广性能更好的混合神经网络模型,并对流加方式进行了再次优化,使小球藻的细胞浓度和最大生产效率分别达到116.2g/l和1.020g/l/h,分别为分批培养中的5.8倍和4倍,高于目前已报道的最高水平. (3)通过对前期建立的动力学模型的比较分析,结合新获得的研究结果,构建了小球藻异养合成叶黄素的动力学模型.该模型能够较好地描述不同条件下分批和流加培养中的实验结果,具有良好的通用性能.基于该模型的分析结果表明:培养过程中葡萄糖浓度在5-24g/l之间,硝酸钾浓度在0.7-12g/l之间有利于小球藻的叶黄素合成.通过对流加培养的优化,叶黄素的产量和生产效率分别达到249.4 mg/l和1.65 mg/1/h,为分批培养中的5.9和4.2倍,高于目前己报道的最高水平. (4)根据有关文献报道和本实验室的测定结果,初步构建了小球藻异养合成叶黄素的代谢网络.通过代谢流分析(metabolic nuX analysis,MFA)发现,在关键代谢节点乙酰辅酶A处,绝大部分代谢流量进入了与细胞生长密切相关的三羧酸循环和结构大分子物质的合成途径,乙酰辅酶A节点的刚性可能是造成小球藻细胞中叶黄素含量难以提高的主要原因.极端代谢流分析的结果表明,叶黄素对葡萄糖的最高理论得率远高于目前的实际得率,显示在小球藻异养合成叶黄素的得率方面还有很大的优化提高空间.根据关于类胡萝卜素合成代谢的文献报道和本研究的相关实验结果,构建了小球藻中类胡萝卜素合成代谢的生化系统理论(biochemieal system theorem,BST)模型,在此基础上分析了培养过程中小球藻比生长速率对细胞中几种类胡萝卜素之间比例和叶黄素含量的影响,并通过模拟计算探讨了提高细胞叶黄素含量的可能优化方式.模拟结果显示,催化乙酰辅酶A转化为番茄红素的代谢途径中相关酶的活力较低,可能是限制小球藻细胞中叶黄素含量提高的瓶颈. (5)对发酵罐中异养培养的小球藻细胞的流变学特性的研究结果显示,在小球藻异养培养过程中培养液的表观黏度值较低且变化不明显,提示培养过程中没有或极少有增加培养液黏度的物质分泌.对浓缩的小球藻悬浮液的流变学研究表明,当小球藻细胞浓度低于150g/1时,小球藻悬浮液呈现牛顿流体特性,黏度较低(<40 mPa·s),且随着细胞浓度的提高缓慢增加;当小球藻细胞浓度继续提高时,小球藻悬浮液转变为非牛顿流体特性,且黏度随着细胞浓度的增加而急剧上升.从流变学的角度考虑,小球藻是一种适合于高密度培养的微藻,在150g/l细胞浓度以下其流变学特性不会成为高效培养体系的障碍. (6)对于采用超临界CO<,2>流体萃取小球藻中叶黄素的可行性进行了初步探讨,对萃取压力、萃取温度、萃取时间以及携带剂等重要操作参数进行了优化研究.当采取萃取压力25 MPa,萃取温度50℃,添加50﹪的乙醇作为携带剂,萃取4h时,叶黄素的提取效率达到87﹪.萃取物的HPLC分析结果显示,通过两级分离方式可以得到较纯的叶黄素产品.这一研究表明,在规模化生产中采用超临界流体萃取技术从小球藻中提取叶黄素是可行的.

目录

文摘

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第一章文献综述

1.1小球藻的生物学特性及其应用

1.1.1小球藻的形态与分布

1.1.2小球藻细胞中有价值的化合物

1.1.3小球藻的应用价值和市场前景

1.2小球藻的培养

1.2.1小球藻的培养方式及规模化生产

1.2.2小球藻的异养培养

1.3叶黄素的生物合成

1.3.1叶黄素的理化特性、生理功能和应用前景

1.3.2类胡萝卜素的生物合成及代谢调控

1.3.3影响类胡萝卜素合成的营养及环境因子

1.4生化过程的动力学模型与优化

1.4.1非结构模型

1.4.2结构模型

1.4.3黑箱模型

1.4.4基于动力学模型的生化过程优化

1.5叶黄素的提取分离

1.5.1叶黄素的提取

1.5.2叶黄素的分离检测

1.5.3超临界CO2流体萃取在类胡萝卜素提取中的应用

1.6本论文的前期工作基础与研究目标

第二章摇瓶条件下小球藻异养培养参数的优化

2.1材料与方法

2.1.1实验试剂和仪器

2.1.2藻株

2.1.3培养基

2.1.4培养条件

2.1.5分析测定方法

2.1.6数据处理

2.2结果与分析

2.2.1接种量对小球藻生长和叶黄素合成的影响

2.2.2通气量对小球藻生长和叶黄素合成的影响

2.2.3葡萄糖起始浓度对小球藻生长和叶黄素合成的影响

2.2.4 KNO3起始浓度对小球藻生长和叶黄素合成的影响

2.2.5 KH2PO4和MgSO4起始浓度对小球藻生长和叶黄素合成的影响

2.2.6培养基主要组分的均匀设计试验及多元回归模型

2.2.7优化与验证

2.3讨论

第三章发酵罐中小球藻异养生长动力学分析及高密度流加培养

3.1材料与方法

3.1.1实验试剂和仪器

3.1.2藻株

3.1.3培养基

3.1.4培养条件

3.1.5分析测定方法

3.1.6确定化模型

3.1.7混合神经网络模型

3.1.8流加优化

3.2结果与讨论

3.2.1小球藻的分批培养及确定化模型的建立

3.2.2基于确定化模型的流加培养的初步优化

3.2.3混合神经网络模型的建立

3.2.4基于混合神经网络模型进行流加培养的进一步优化

3.2.5混合神经网络模型与确定化模型的比较

3.2.6小球藻比生长速率与葡萄糖浓度之间的关系

3.3小结

第四章小球藻异养合成叶黄素的动力学模型与优化

4.1材料与方法

4.1.1实验试剂和仪器

4.1.2藻株

4.1.3培养基

4.1.4培养条件

4.1.5分析测定方法

4.1.6模型参数估计及模拟

4.2结果与讨论

4.2.1对前期建立的小球藻异养分批培养动力学模型的分析讨论

4.2.2小球藻异养分批培养动力学模型的构建

4.2.3在不同溶氧浓度和不同发酵罐中小球藻异养培养的动力学分析

4.2.4流加培养的动力学模型及其验证

4.2.5碳源和氮源浓度对小球藻叶黄素合成的影响

4.2.6小球藻异养合成叶黄素的优化

4.2.7小球藻异养培养过程中叶黄素生产效率和细胞中叶黄素含量的动态分析

4.3小结

第五章小球藻异养合成叶黄素的代谢网络分析

5.1材料与方法

5.1.1实验试剂和仪器

5.1.2藻株

5.1.3培养基

5.1.4培养条件

5.1.5分析测定方法

5.1.6数据处理软件

5.2结果与讨论

5.2.1小球藻异养生长和叶黄素合成代谢网络的构建

5.2.2小球藻生长所需前体流量的计算

5.2.3小球藻异养生长和叶黄素合成的代谢流计算

5.2.4极端代谢流分析及叶黄素得率提高的可能性

5.2.5小球藻叶黄素合成途径中相关类胡萝卜素的鉴定

5.2.6小球藻叶黄素合成代谢的生化系统理论模型

5.2.7生化系统理论模型的实验支持

5.2.8基于生化系统理论模型探讨提高小球藻细胞叶黄素含量可能的优化方式

5.3小结

第六章异养小球藻细胞流变学特性的研究

6.1材料与方法

6.1.1实验试剂和仪器

6.1.2藻株

6.1.3培养基

6.1.4培养条件

6.1.5分析方法

6.2结果与讨论

6.2.1发酵罐异养培养过程中小球藻培养液的黏度变化

6.2.2浓缩小球藻细胞悬浮液的表观黏度

6.2.3浓缩小球藻细胞悬浮液的流变学特性

6.3小结

第七章小球藻中叶黄素超临界CO2流体萃取的初步研究

7.1材料与方法

7.1.1实验试剂和仪器

7.1.2小球藻的高密度培养及小球藻超微细粉的制备

7.1.3超临界萃取装置及流程

7.1.4分析和鉴定方法

7.2结果与讨论

7.2.1萃取温度对叶黄素提取效率的影响

7.2.2萃取压力对叶黄素提取效率的影响

7.2.3携带剂对叶黄素提取效率的影响

7.2.4萃取时间对叶黄素提取效率的影响

7.2.5萃取样品的HPLC分析及HPLC-MS鉴定

7.3小结

第八章结论与创新性

8.1主要结论

8.2创新性

参考文献

致 谢

攻读学位期间发表的学术论文