羊水来源OCT-4阳性胎儿干细胞的分离和培养及其生物学特性研究

摘要

目的：OCT-4是控制干细胞分化、决定干细胞全能性的关键物质。在发现羊水中存在OCT-4阳性干细胞的基础上，本研究拟以SSEA-4和CD44交叉结合分离的方法，从羊水细胞中分离OCT-4阳性的全能干细胞，鉴定其生物学性状和分化潜能，并建立稳定的细胞系。本研究有望为获得人类的、能向内、中、外三个胚层组织细胞定向分化的全能干细胞提供一种安全、简便的方法，为组织工程开辟新的种子细胞来源。 方法：在知情同意的条件下，通过羊膜腔穿刺获取人孕16～22周羊水50ml，利用SSEA-4和CD44交叉结合分离的方法，通过免疫磁珠的微磁场分离作用，从羊水中分离出SSEA-4+CD44- 、SSEA-4+CD44+、 SSEA-4-CD44- 和SSEA-4-CD44+细胞，培养扩增，免疫荧光染色鉴定OCT-4阳性率，选择最佳的分选组合，观察其生物学特性：细胞生长周期，生长曲线，构建类胚体，分析细胞性质：检测NANOG、AKP、Myosin、Vimentin、Desmin、Nestin、MAP-2、FN、Sox-2、Runx-1和Rex-1等细胞因子的表达情况。取第三代OCT-4阳性细胞，使其向肝细胞诱导分化，通过形态学观察，免疫组化，RT-PCR和Western-Blot检测白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(α-AFP)、CK18和CK19的表达，评价诱导效果。将生长旺盛的第三代OCT-4阳性干细胞种植于裸鼠背部皮下，通过HE切片和三个胚层特异性染色对羊水干细胞的成瘤性进行研究和分析。 结果： 1.原代羊水细胞在体外培养体系中增殖迅速，形成上皮细胞样克隆和长梭形细胞样克隆，流式细胞仪和免疫荧光染色显示部分细胞表达CD44和SSEA-4。 2.通过免疫磁珠细胞分选法，利用SSEA-4和CD44交叉结合分离原理，可从原代羊水细胞中分离得到SSEA-4+CD44- 、SSEA-4+CD44+、 SSEA-4-CD44- 和SSEA-4-CD44+细胞，OCT-4免疫荧光染色结果显示：SSEA-4+CD44-组细胞和SSEA-4+CD44+组细胞OCT-4阳性率最高，分别达90％和91％，而SSEA-4-CD44- 组细胞和SSEA-4-CD44+组细胞均未检测到OCT-4表达，对SSEA-4+CD44+ 和SSEA-4+CD44-细胞进行后续研究发现，该两组细胞均表达NANOG、Vimentin、Desmin、Nestin、MAP-2、FN、Sox-2、Runx-1和Rex-1等细胞因子，明确SSEA-4是分离OCT-4阳性干细胞必须标志，SSEA-4阳性细胞的纯化可以显著提高OCT-4阳性率，而间充质干细胞表面标志CD44和OCT-4阳性率无明显关联。 3.OCT-4阳性干细胞经20ng/ml HGF和10ng/ml bFGF诱导14天后呈典型的多角形和短梭形肝细胞样细胞，表达ALB、 CK18和CK19。 4.OCT-4阳性胎儿干细胞植入裸鼠背部皮下2周，有瘤样新生物形成，HE染色见瘤内结构紊乱，细胞成分复杂，内胚层染色(HNF-3β)、中胚层染色(Desmin、Vimentin)和神经外胚层染色(tubulin)均为阳性。 结论： SSEA-4可作为分离纯化OCT-4阳性干细胞的标志，SSEA-4+细胞的OCT-4阳性率高，增殖分化能力强，符合作为组织工程种子细胞的条件，显示孕中期羊水可以为组织工程研究提供新的种子细胞来源。