C型利尿钠肽对小鼠小肠Cajal间质细胞起搏电流的影响及机制

摘要

众多的研究结果表明：Cajal间质细胞(interstitialcellsofCajal，ICC)是胃肠道平滑肌慢波的起搏细胞。根据它们在胃肠道内分布位置的差异，可以分为肌间ICC和肌内ICC两大类。二者在起搏电流的产生、传播、神经信息传递等方面承担着不同的功能。C型利尿钠肽(C-typenatriureticpeptide，CNP)是利尿钠肽家族的一员，它不仅分布广泛，而且具有多种生物学功能。以往的研究表明：利尿钠肽家族对胃肠运动具有抑制性调节作用，而这种抑制作用是否也可以通过影响ICC起搏电流的形成来实现，国内外还未见相关的报道。 在研究中，采用免疫细胞化学技术对培养的ICC进行鉴定。应用膜片钳技术的多种钳制模式，观察了ICC起搏电流的特性；用免疫双标法，检测了利尿钠肽受体在ICC的表达；用全细胞膜片钳技术观察了CNP对网络和单个ICC起搏电流的影响；进一步应用cGMP的拟似物等工具药物来研究CNP影响起搏电流的机制；用膜内面向外和细胞吸附模式观察了CNP和cGMP对起搏电流形成相关的离子通道活性的影响。 结果表明：①培养的大部分细胞均为C-Kit抗体阳性表达。②在全细胞模式下，高浓度钙鳌合剂使细胞内游离钙浓度降低后，ICC上可以激活持续性内向电流：在膜内面向外的膜片钳模式下，当膜外钙离子浓度由1μmol/L降低到0.1μmol/L时，激活幅度大、频率快的自发性内向电流。③在全细胞模式下，钙调蛋白抑制剂W-7可以增加ICC自发性内向电流的幅度；在细胞吸附模式下，W-7激活幅度大、频率快的自发性内向电流。也有一种细胞的电生理学特性却不受细胞内低钙环境和钙调蛋白抑制剂W-7的影响。④免疫双标法证实，利尿钠肽受体A和B在ICC表面呈阳性表达。⑤在全细胞钳制模式下，在网络式生长的ICC记录到幅度为322±22pA，频率为16.25±0.95Hz的起搏电流；CNP对网络ICC起搏电流的幅度和频率具有明显的抑制作用，并具有剂量依赖性，当CNP的浓度分别为0.01μmol/L、0.1μumol/L和1μmol/L时，可以将起搏电流的幅度抑制到对照组的76.05±1.51％、38.24±3.74％和18.33±2.86％，将起搏电流的频率从16.25±0.95Hz抑制到13±0.9Hz、12±0.8Hz和3±0.2Hz。⑥膜通透性8-Br-cGMP可以模拟CNP对起搏电流的抑制作用，cGMP敏感的磷酸酯酶抑制剂Zaparinast可以增强CNP对起搏电流的抑制作用。⑦在细胞吸附模式下，CNP和8-Br-cGMP对钙调蛋白抑制剂W-7诱发的ICC自发性内向电流具有明显的抑制作用。⑧在膜内面向外的膜片钳模式下，细胞内低钙诱发的自发性内向电流不被8-Br-cGMP抑制。⑨在全细胞模式下，细胞内高浓度钙螯合剂使胞内钙浓度持续降低所引发的内向电流不被CNP和8-Br-cGMP抑制。 研究结果提示：①在小鼠小肠分离培养的ICC上能够记录到自发性瞬间内向性电流，即起搏电流，这种起搏电流的产生与胞内低钙和钙调蛋白抑制剂敏感的离子通道有关。②在培养的ICC中对细胞内低钙和W-7敏感的细胞可能就是具有起搏功能的肌层间ICC(myentericICC，ICC-MY)。③CNP可以直接作用于小肠ICC抑制其起搏电流，对平滑肌运动起抑制性调节。④CNP对小肠ICC起搏电流的抑制作用通过Cajal间质细胞胞膜上利尿钠肽受体.膜结合性鸟苷酸环化酶-cGMP途径实现。⑤cGMP可能通过改变Caial间质细胞胞内钙离子浓度影响起搏电流。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略语

声明

第1章小鼠小肠Cajal间质细胞的培养及其电生理特性的研究

1.1引言

1.2实验材料与方法

1.2.1实验仪器

1.2.2试剂

1.2.3主要药品及溶液的配制

1.3实验方法

1.3.1小鼠小肠Caial间质细胞的分离培养

1.3.2小鼠小肠Caial间质细胞的鉴定

1.3.3膜片钳实验技术

1.3.4统计学方法

1.4实验结果

1.4.1培养细胞的形态学观察

1.4.2培养细胞的免疫学鉴定

1.4.3培养的Cajal间质细胞起搏电流的观察

1.4.4胞内低钙对Cajal间质细胞起搏电流的影响

1.4.5钙调蛋白抑制剂W-7对Cajal间质细胞起搏电流的影响

1.5讨论

1.6小结

参考文献

第2章CNP对小鼠小肠Cajal间质细胞起搏电流的影响及机制

2.1引言

2.2实验材料与方法

2.2.1实验仪器

2.2.2试剂

2.2.3主要药品及溶液的配制

2.3实验方法

2.3.1小鼠小肠Cajal间质细胞的分离培养

2.3.2 NPR在小鼠小肠Cajal间质细胞表达的鉴定

2.3.3膜片钳实验技术

2.3.4统计学方法

2.4实验结果

2.4.1利尿钠肽受体A和B在Caial间质细胞的表达

2.4.2 C型利尿钠肽对Caial间质细胞起搏电流的影响

2.4.3 cGMP拟似物对起搏电流的影响

2.4.4 Zaprinast对CNP抑制起搏电流作用的影响

2.4.5 CNP和cGMP拟似物对起搏通道活性的影响

2.4.6胞内低钙时CNP和cGMP对起搏电流的影响

2.5讨论

2.6小结

参考文献

第3章文献综述：胃肠道Cajal间质细胞的研究进展

3.1 ICC的分布及发育特点

3.1.1 ICC的分布

3.1.2 C-Kit信号与ICC的发育

3.2起搏活动的产生及传播机制

3.2.1 ICC是胃肠道的起搏细胞

3.2.2起搏电流的构成

3.2.3起搏电流的产生机制

3.2.4起搏电流的传播机制

3.3器官的起搏特点

3.4 ICC与胃肠神经的关系

3.5 ICC与胃肠疾病的关系

3.5.1胃肠动力性疾病

3.5.2胃肠道基质肿瘤

3.6研究展望

参考文献

致谢

在学期间已发表或录用的文章