药用植物ABC转运蛋白基因的克隆与特征研究

摘要

植物次生代谢产物中许多成分具有极高的药用价值，如红豆杉产生的紫杉醇等次生代谢产物在临床治疗中、晚期癌症中疗效明显，长春花产生的长春碱和长春新碱等多种次生代谢产物具有抗肿瘤等作用，而银杏产生的黄酮类化合物和银杏内酯等次生代谢产物也因其越来越多的药用价值被发现而引起人们的广泛关注。然而，天然植株中许多目标次生代谢产物含量极低，而且由于人们对药用植物的盲目采集，许多植物趋于濒危，而引种栽培、化学合成及植物组织培养等由于成本高、产量低，阻碍了次生代谢产物的商业化生产。人们发现开展植物次生代谢工程和代谢调控研究是提高植物次生代谢产物含量的有效方法之一。系统深入研究药用次生代谢产物生物合成途径及其累积的分子调控机理是利用基因工程技术提高药用次生代谢产物含量的前提和关键。其中，ABC(ATP-BindingCassette)转运蛋白由于可将植物细胞产生的有毒次生代谢产物从细胞内转运到细胞外或胞内细胞器以减少对细胞自身的毒性，已成为植物代谢工程和代谢调控研究的重要方向之一。 红豆杉(Taxus)、长春花(Catharanthusroseus)和银杏(Ginkgobiloba)是可产生重要次生代谢产物的药用植物，是植物次生代谢研究的重要材料。为了深入了解这三种药用植物中重要次生代谢产物生物合成与累积的分子机制，本文从ABC转运蛋白及其相关基因的克隆和表达分析等方面开展了一系列的工作，取得了以下结果： 1.成功地从东北红豆杉中克隆了第一个ABC转运蛋白基因Tcmdrl(GenBank登录号：DQ660357)。该基因属于MDR亚家族，全长cDNA为4485bp，含有一个长度为3951bp的开放阅读框，编码一个具有1316个氨基酸残基的蛋白。序列比对和结构预测发现，TcMDR1蛋白与其它MDR蛋白尤其是植物MDR蛋白具有较高的同源性，TcMDR1蛋白有两个跨膜域TMD和两个核苷酸结合域NBD按照正向的“TMD1-NBD1-TMD2-NBD2”顺序排列，这与典型的有功能的MDR类ABC转运蛋白是一致的，而且在TcMDR1蛋白序列中也发现了所有ABC转运蛋白共同的高度保守基序：“WalkerA”、“WalkerB”和C基序，这表明TcMDR1可能与其他MDR类ABC转运蛋白一样都是通过结合和水解ATP为特定的底物转运提供能量。组织特异性表达分析结果表明，Tcmdrl在根、茎和叶中的表达都很高。Southernblot结果显示，东北红豆杉中Tcradrl基因属于一个小基因家族。此外，还成功构建了含Tcmdrl的酵母表达载体pDR196-Tcmdrl并转化了酵母突变菌株AD12345678，得到了酵母转化菌株。进一步通过TcMDR1蛋白表达的检测和底物分析确定TcMDR1蛋白的转运功能将有助于深入研究TcMDR1在提高特定药用次生代谢产物中的潜在作用。 2.成功地从长春花中克隆了第一个ABC转运蛋白基因Crmdrl(GenBank登录号：DQ660356)。该基因属于MDR亚家族，全长cDNA为4395bp，含有一个3801bp的开放阅读框，编码一个具有1266个氨基酸残基的蛋白。序列比对和结构预测发现，CrMDR1蛋白与其它MDR蛋白具有较高的同源性，而且预测的CrMDR1蛋白与TcMDR1一样具有典型的MDR类ABC转运蛋白的结构特点，这表明CrMDR1可能与其他MDR类ABC转运蛋白一样能通过结合和水解ATP为特定底物的转运提供能量。组织特异性表达分析结果表明，Crmdrl基因在叶片中表达较弱，而在根和茎等部位表达量较高。Southernblot结果显示，长春花中Crmdrl基因属于一个小基因家族。 3.成功地从银杏中克隆了第一个ABC转运蛋白基因Gbmdrl(GenBank登录号：DQ779968)。该基因属于MDR亚家族，全长cDNA为4275bp，含有一个3840bp的开放阅读框，编码一个具有1279个氨基酸残基的蛋白。序列比对和结构预测发现，GbMDR1与其它MDR蛋白具有较高的同源性，预测的GbMDR1蛋白具有典型的MDR类ABC转运蛋白的结构特点，这表明GbMDR1可能与其他MDR类ABC转运蛋白具有同样的功能，即通过结合和水解ATP为特定底物的转运提供能量。组织特异性表达分析结果表明，Gbmdrl基因在根中表达水平极低，而在茎和叶等部位表达量较高。Southernblot结果显示银杏中Gbmdrl基因属于一个小基因家族。 4.对药用植物MDR类ABC转运蛋白基因进行了初步比较研究。序列比较结果显示，长春花CrMDR1、黄芪CjMDR和东北红豆杉TcMDR1蛋白同源性较高(超过60％)，而银杏GbMDR1同源性则相对较低，仅为40％左右，这可能与银杏这一物种进化上较为古老有关。研究还发现，GbMDR1和TcMDR1蛋白结构中都具有AtPGP4和CjMDR等内向摄取蛋白共有的N末端突出卷曲序列，推测GbMDR1和TcMDR1可能也具有内向摄取功能，进一步的酵母和植物转化及底物分析研究将有助于对这三个ABC转运蛋白进行确切的功能鉴定。进化树分析显示MDR蛋白总体分为三簇，其中药用植物MDR蛋白CrMDR1、CjMDR和TcMDR1都位于第Ⅰ簇，与内向转运蛋白AtMDR4同在一簇中。通过组织特异性表达分析比较发现，这四个基因的组织表达谱不相同，对其进行功能分析将有助于阐明药用植物中MDR类ABC转运蛋白的主要作用机制及这些机制与药用次生代谢产物累积的关系，为进一步通过基因工程方法提高目的次生代谢产物含量提供依据。 5.对紫杉醇累积相关ABC转运蛋白基因进行研究需要详细了解紫杉醇的生物合成途径。本研究首次成功地从曼地亚红豆杉中克隆了一个紫杉醇生物合成相关基因Tmmecs(GenBank登录号：DQ286391)，该基因编码2-C-甲基-D-赤藓醇-2，4-环焦磷酸合成酶，全长cDNA为1081bp，含有一个741bp的开放阅读框，编码一个具有247个氨基酸残基的蛋白。序列比对和进化分析结果显示，TmMECS蛋白与其它植物MECS蛋白具有较高的同源性。同源三维结构建模分析显示，TmMECS与E.coli来源的MECS蛋白具有相似的三维空间结构，而且在TmMECS结构中也发现了MECS蛋白家族中高度保守的氨基酸残基Asp98、His100和His132，提示TmMECS与其他MECS可能具有相似的生物学功能；组织特异性表达分析表明，Tmmecs是一个组成型表达的基因，在植物根、茎和叶中均呈高水平表达。Southernblot杂交结果显示Tmmecs基因属于一个小基因家族。通过将该基因在大肠杆菌中的超量表达实验证实该酶能够推动大肠杆菌中β-胡萝卜素合成的代谢流向下游流动导致β-胡萝卜素的累积增加，从而证明了TmMECS蛋白具有催化功能。 本文从东北红豆杉、长春花和银杏三种药用植物中分别克隆了一个MDR类ABC转运蛋白基因并对其进行了结构及生物信息学分析，为今后对植物ABC转运蛋白中MDR这类最大的全分子亚家族进行克隆及功能研究提供了重要的实验依据；对四个药用植物MDR类ABC转运蛋白基因的结构及组织表达进行了比较分析，对其进行功能分析将有助于阐明药用植物中MDR类ABC转运蛋白的主要作用机制及这些机制与药用次生代谢产物累积的关系，为进一步通过基因工程方法提高目的次生代谢产物含量提供依据；从曼地亚红豆杉中克隆了紫杉醇生物合成相关基因Tmmecs并验证了功能，丰富了紫杉醇生物合成途径研究的基因资源，也为进一步研究红豆杉中与紫杉醇累积相关的ABC转运蛋白基因提供了前提和基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词表

声明

第一章文献综述

1.1植物次生代谢产物

1.2 ABC转运蛋白

1.2.1 ABC转运蛋白的结构域组织

1.2.2 ABC转运蛋白的高级结构

1.2.3 ABC转运蛋白的作用机理

1.2.4植物ABC转运蛋白

1.3 ABC转运蛋白在植物次生代谢产物转运中的作用

1.3.1转运内源次生代谢产物的ABC转运蛋白

1.3.2由非植物ABC转运蛋白进行的次生代谢产物转运

1.3.3 ABC转运蛋白被植物次生代谢产物调节

1.3.4底物识别

1.4本研究的目的与意义

第二章材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株和质粒

2.1.3主要仪器设备

2.1.4试剂、酶与药品

2.2实验方法

2.2.1 RACE cDNA文库的构建

2.2.2基因组步移文库的构建

2.2.3 DNA片段的回收、连接、克隆和测序

2.2.4东北红豆杉中ABC转运蛋白基因Tcmdr1的克隆和性质研究

2.2.5长春花中ABC转运蛋白基因Crmdr1的克隆和性质研究

2.2.6银杏中ABC转运蛋白基因Gbmdr1的克隆和性质研究

2.2.7药用植物MDR类ABC转运蛋白的比较研究

2.2.8曼地亚红豆杉中ABC转运蛋白相关基因Tmmecs的克隆和性质研究

第三章东北红豆杉中ABC转运蛋白基因Tcmdr1的克隆与特征研究

3.1前言

3.2 Tcmdr1基因全长cDNA的克隆及其特征分析

3.3 TcMDR1蛋白的特征分析

3.4 Tcmdr1基因的系统发生树分析

3.5 Tcmdr1基因的组织特异性表达分析

3.6 Tcmdr1基因的Southern blot分析

3.7Tcmdr1基因酵母异源表达载体的构建

3.8 Tcmdr1研究小结

第四章 长春花中ABC转运蛋白基因Crmdr1的克隆与特征研究

4.1前言

4.2 Crmdr1基因全长cDNA的克隆及其特征分析

4.3 Crmdr1基因启动子序列的克隆及分析

4.4 CrMDR1蛋白的特征分析

4.5 Crmdr1基因的系统发生树分析

4.6 Crmdr1基因的组织特异性表达分析

4.7 Crmdr1基因的Southern blot分析

4.8 Crmdr1研究小结

第五章银杏中ABC转运蛋白基因Gbmdr1的克隆与特征研究

5.1前言

5.2 Gbmdr1基因全长cDNA的克隆及其特征分析

5.3 Gbmdr1启动子序列的克隆及分析

5.4 GbMDR1蛋白的特征分析

5.5 Gbmdr1基因的系统发生树分析

5.6 Gbmdr1基因的组织特异性表达分析

5.7 Gbmdr1基因的Southern blot分析

5.8研究小结

第六章药用植物MDR类ABC转运蛋白基因的比较研究

6.1前言

6.2蛋白序列比较

6.3进化树分析

6.4基因的组织表达比较

6.5研究小结

第七章曼地亚红豆杉中紫杉醇合成途径相关基因Tmmecs的克隆与特征研究

7.1前言

7.2 Tmmecs基因全长cDNA的克隆及其特征分析

7.3 TmMECS蛋白的特征分析

7.4 TmMECS蛋白的三维模型分析

7.5 Tmmecs基因的系统发生树分析

7.6 Tmmecs基因的组织特异性表达分析

7.7 Tmmecs基因的Southern blot分析

7.8 Tmmecs基因的功能验证

7.9 Tmmecs研究小结

第八章总结与展望

8.1研究结论

8.2本研究的主要创新点

8.3后续研究方向

参考文献

附录

致谢

攻读博士学位期间发表的论文