活性氧在糖尿病性视网膜病变中作用机制及干预研究

摘要

目的：阐明活性氧(reactive oxygen species，ROS)在糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)中的作用机制，探讨色素上皮源性因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)对高糖孵育的细胞凋亡的影响以及他汀类药物辛伐他汀和血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitors，ACEI)培多普利对糖尿病大鼠视网膜病变的作用。
　　 方法：(1)原代培养牛视网膜微血管内皮细胞(bovine retinal capillaryendothelial cells，BRECs)，分别在正常浓度葡萄糖(5mM)、高浓度葡萄糖(30Mm)、高浓度葡萄糖联合ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)(10mM)、高浓度葡萄糖联合Janus激酶2(JanusKinase2，JAK2)抑制剂AG490(10μM)、高浓度葡萄糖联合PEDF(100nM)以及高浓度葡萄糖联合NADPH氧化酶抑制剂二亚苯基碘鎓(diphenyleneiodonium，DPI)(10μM)的DMEM培养基中培养，应用TUNEL检测细胞凋亡率，荧光检测仪测定细胞ROS浓度和NADPH氧化酶活性，RT-PCR及western blot分别检测细胞血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)mRNA及其蛋白、JAK2和信号转导转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription3，STAT3)蛋白及其磷酸化蛋白表达。(2)链脲霉素(streptozotocin，STZ)腹腔注射(60mg/Kg)建立大鼠糖尿病模型，运用免疫组化检测视网膜组织中JAK2/STAT3磷酸化蛋白表达，RT-PCR及western blot分别检测大鼠视网膜组织VEGF mRNA及其蛋白、JAK2/STAT3蛋白及其磷酸化蛋白表达，并作相关关系分析。(3)使用以上糖尿病动物模型，成模后1周，辛伐他汀予以干预(4mg/kg/day溶解于供鼠饮用的水中灌胃)6个月，并设立对照；同时使用高糖联合辛伐他汀(5μM)等孵育BRECs。运用消化铺片评定视网膜血管组织周细胞和无细胞毛细血管数，免疫共沉淀检测组织及细胞聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase，PARP)活性，运用RT-PCR及western blot分别检测组织和细胞血管生成素-2(Angiopoietin-2，Ang-2)和VEGF mRNA及其蛋白以及细胞解耦联蛋白-2(uncoupling protein-2，UCP-2)mRNA及其蛋白表达，应用流式细胞术检测线粒体膜电位，ROS浓度和NADPH氧化酶活性检测方法同方法(1)。(4)收集21例1型糖尿病伴增生性糖尿病性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)患者和16特发性黄斑裂孔(idiopathic macular hole，IMH)患者玻璃体，运用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)测定玻璃体VEGF和PEDF水平；使用以上糖尿病动物模型，成模后1周，培多普利予以干预(2mg/kg/day溶解于供鼠饮用的水中灌胃)6个月，并设立对照；同时使用高糖联合培多普利(10μM)等孵育BRECs。运用透射电镜测定视网膜血管基底膜厚度(capillary basement membrane thickness，BMT)，应用ELISA检测细胞膜及胞浆蛋白激酶C(protein kinases C，PKC)活性，运用RT-PCR及western blot分别检测组织和细胞VEGF和PEDF mRNA及其蛋白以及细胞UCP-2 mRNA及其蛋白和过氧化酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activatedreceptor(PPAR)-gama，PPARγ)mRNA及其蛋白水平表达。视网膜血管组织周细胞和无细胞毛细血管形成数、ROS浓度、NADPH氧化酶活性和线粒体膜电位检测方法分别同方法(1)、(2)和(3)。
　　 结果：(1)同对照组比较，高糖诱导BRECs ROS产生显著性增加，JAK2/STAT3大量磷酸化，使得VEGF mRNA及其蛋白表达上调，同时伴随高糖孵育BRECs凋亡显著性增加(p＜0.01)；PEDF治疗可显著性抑制这些变化(p＜0.05)。(2)糖尿病大鼠与对照组大鼠比较，视网膜组织JAK2/STAT3磷酸化蛋白表达显著性上调(p＜0.01)，而JAK2/STAT3表达无显著性变化。同时，VEGF mRNA及其蛋白表达增加(p＜0.01)，且 VEGF蛋白表达与STAT3蛋白磷酸化呈显著性正相关(p=0.01)。糖尿病组视网膜JAK2/STAT3磷酸化蛋白免疫光斑主要位于神经节细胞层及内核层，且糖尿病组阳性斑点强于对照组。(3)辛伐他汀治疗显著性降低糖尿病大鼠视网膜组织PARP活性以及Ang-2和VEGF mRNA及其蛋白表达(p＜0.05)，且伴随其周细胞凋亡和无细胞毛细血管形成减少(p＜0.05)。糖尿病大鼠视网膜聚腺苷二磷酸核糖化PARP蛋白免疫光斑主要位于神经节细胞层及内核层，在外界膜和色素上皮层也可见弱的光斑。糖尿病组阳性斑点强于对照组，辛伐他汀治疗后，其阳性斑点变弱。体外实验结果显示，辛伐他汀可上调高糖孵育的BRECs UCP-2 mRNA及其蛋白表达以降低线粒体膜电位以及抑制NADPH氧化酶激活，从而减少ROS生成，抑制PARP激活，使得Ang-2和VEGF mRNA及其蛋白表达下调。(4)同IMH患者比较，PDR患者玻璃体VEGF水平显著性升高，PEDF水平显著性下降(p＜0.01)。与之形成鲜明对比的是，糖尿病大鼠视网膜组织VEGF和PEDF mRNA及其蛋白水平均显著性上调(p＜0.01)，培多普利可显著性抑制这些变化(p＜0.01)，并伴随视网膜血管周细胞凋亡及无细胞毛细血管形成减少和BMT变薄(p＜0.05)。体外实验结果显示，培多普利通过上调高糖孵育的BRECs PPARγ/UCP-2表达，抑制ROS调节的PKC激活，导致VEGF/PEDF比值下降(VEGF下调且PEDF上调)。
　　 结论：(1)ROS可通过JAK2/STAT3/VEGF通路、PARP/Ang-2、VEGF通路以及PKC/VEGF、PEDF通路等激活在糖尿病大鼠视网膜病变发病中发挥重要作用。ROS以及与之相关的这些通路可能成为DR防治的有效靶点。(2)PEDF通过对NADPH氧化酶的抑制，减少高糖诱导的细胞ROS生成，使得JAK2/STAT3磷酸化蛋白下调，从而防止高糖诱导的血管内皮细胞凋亡。JAK2/STAT3可能是PEDF的有效靶点。(3)他汀类和ACEI分别通过对NADPH氧化酶和线粒体通路调节的ROS/PARP轴和ROS/PKC轴的抑制，显著缓解糖尿病大鼠视网膜血管组织损伤。他汀类和ACEI可能是DR防治的有效药物，具有潜在的临床应用前景。本研究的这些系列发现，将为DR的防治提供科学依据，具有一定的理论意义和现实价值。

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英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分活性氧在高糖孵育的牛视网膜血管内皮细胞凋亡中的作用机制及在糖尿病鼠视网膜病变中的意义

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分色素上皮源性因子抑制高糖孵育的牛视网膜血管内皮细胞凋亡的作用机制

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分辛伐他汀对糖尿病鼠视网膜病变的作用及其机制

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第四部分培多普利对糖尿病鼠视网膜病变的作用及其机制

材料和方法

结果

讨论

参考文献

小结

综述糖尿病并发症统一机制学说与糖尿病性视网膜病变

博士期间论文情况

博士期间参与或主持的项目的奖励情况

致谢