骨吸收抑制剂和骨形成促进剂对骨质疏松性骨折愈合影响的实验研究

摘要

背景： 骨质疏松性骨折的治疗包括外科干预、积极应用抗骨质疏松性药物、功能锻炼等。其中对骨质疏松性骨折患者进行外科干预、以及在术后开展功能锻炼的技术与观点比较一致，但是对骨质疏松性骨折患者如何使用抗骨质疏松药物、何时使用和使用何种类型的抗骨质疏松药物尚没有形成一致意见，也缺乏详细的研究。阿伦膦酸钠和1，25(OH)2D3作为临床上使用最为广泛的两种治疗骨质疏松的药物，分别作为骨吸收抑制剂和骨形成促进剂的代表，已经在众多的骨质疏松患者中广泛使用。观察其对于骨质疏松性骨折愈合的影响，特别是进行围骨折期用药选择的实验研究，对于指导骨质疏松性骨折患者如何用药具有很大的临床实际意义。 目的： 利用雌性去势大鼠骨质疏松模型，探讨围骨质疏松性骨折期使用骨吸收抑制剂(阿伦磷酸钠)对骨折愈合的影响，并阐明其作用的分子生物学机制。同时评价骨形成促进剂(1，25(OH)2D3)对骨质疏松性骨折愈合的影响。 方法： 根据研究目的，本研究分为三个部分。 1.骨髓基质干细胞(BMSCs)取自9月龄去势SD大鼠，分别暴露于0.01、0.1、1、10μmol/L阿伦瞵酸钠。在成骨诱导和成脂诱导条件下，2周后进行碱性磷酸酶(ALP)染色和定量分析、油红O染色和镜下计数分析，同时使用RT-PCR检测特异标志基因的表达。使用MAPK通路特异性抑制剂并诱导2周后，再观察标志基因的表达情况。Westernblot观察药物对MAPK表达的影响。 2.60只雌性SD大鼠随机分为4组，即对照组(Saline/Saline)、骨折前用药组(Aln/Saline)、骨折后用药组(Saline/Aln)和持续用药组(Aln/Aln)。阿伦膦酸钠溶于生理盐水中，灌胃服用，剂量为3mg/kg/day。对照组使用等量的生理盐水。每周称量大鼠体重，并根据体重变化进行药品剂量调整。所有实验动物在进入研究时均进行去势手术，三个月后再制备骨折模型。骨折后6周、16周收取骨折标本，进行X线摄片、micro-CT扫描分析、三点弯曲实验和组织学观察。 3.40只雌性SD大鼠随机分为2组：实验组和对照组。所有实验动物在进入研究时均进行去势手术，三个月后再制备骨折模型。1，25(OH)2D3溶于中链甘油三酯中，口服剂量为0.1microg/kg/day，对照组服用等量的中链甘油三酯。骨折后6周、16周收取骨折标本，进行X线摄片、micro-CT扫描分析、三点弯曲实验和组织学观察。 结果： 1.BMSCs经成骨诱导2周后，阿伦膦酸钠组ALP染色面积明显增大，定量分析显示ALP活性增高1～2倍(p＜0.001)。骨形态发生蛋白-2、Runx2、骨桥蛋白和骨涎蛋白的表达随着药物浓度的增高而逐渐增强，其效应具有浓度依赖性(p＜0.001)。BMSCs经成脂诱导2周后，油红O染色阳性细胞数随着药物浓度的增高而逐渐减少(p＜0.001)。PPARγ2的表达随着药物浓度的增高而逐渐降低。分别使用ERK1/2、JNK抑制剂PD98059和SP600125并诱导2周后，BMP-2、Runx2表达下调而PPARγ2表达上调。使用p38抑制剂SB203580并诱导2周后，BMP-2、Runx2表达无明显变化而PPARγ2表达下调。Westernblot显示：阿伦膦酸钠在5、15、30min时上调p-ERK1/2和p-JNK表达，分别使用抑制剂后，其表达下调。 2.骨折后6周，与对照组比较，使用阿伦膦酸钠组的骨折线更加模糊，骨痂明显增大。micro-CT的重建图像进一步证实了该结果，形态计量分析显示：使用阿伦膦酸钠组的TV、BV、BV/TV、Tb.Th和表观骨密度均较对照组增大，差异具有统计学意义(p＜0.001)。三点弯曲实验显示：各组间骨痂的最大载荷和吸收能量均高于对照组，以联合组最大。HE染色示：使用阿伦磷酸钠后，骨痂组织为大量幼稚的软骨组织，而对照组软骨性骨痂较多，部分转换为骨性组织。骨折后16周，X线示各组骨折线均消失，使用阿伦磷酸钠组的骨痂较6周时缩小，但仍大于对照组。micro-CT示对照组骨折处连接良好，基本完成骨重建过程，而使用阿伦磷酸钠组的骨痂改建延缓，骨折处有大量不成熟编织骨组织。基于micro-CT的形态计量分析显示TV、BV、BV/TV、Tb.Th和表观骨密度均较对照组增大，差异具有统计学意义(p＜0.001)。三点弯曲实验示各组间的最大载荷和吸收能量均有统计学差异(p＜0.001)。HE染色示对照组骨折断端间达到骨性连接，而使用阿伦膦酸钠组的骨折断端间由排列不规则的大量编织骨相连。 3.骨折后6周，与对照组比较，实验组骨折线更加模糊。micro-CT示实验组骨折断端间有骨性骨痂连接，骨痂轻微增大；形态计量分析示TV、BV、BV/TV、Tb.Th、Tb.N和表观骨密度均较对照组增大，差异具有统计学意义(p＜0.001)。实验组最大载荷和吸收能量均显著大于对照组，差异具有统计学意义(p＜0.001)。HE染色显示实验组骨折处形成较多编织骨样组织，而对照组形成较多软骨样骨痂组织。骨折后16周，两组骨折线均消失。micro-CT示实验组骨痂改建良好，基本达到完全骨性连接，形态计量分析显示Tb.Th、Tb.N和表观骨密度均较对照组增大，差异具有统计学意义(p＜0.001)。三点弯曲实验示实验组最大载荷和吸收能量均高于对照组，差异具有统计学意义(p＜0.05)。HE染色示实验组骨折愈合良好，骨折处为排列一致的板层骨，而对照组有少量排列不规则的骨组织。 结论： 1.阿伦膦酸钠通过激活ERK1/2和JNK信号途径，而不是p38，发挥促进骨质疏松大鼠来源的骨髓基质干细胞成骨分化，并抑制其成脂分化，其作用具有浓度依赖性。 2.围骨质疏松性骨折期不同时间段使用阿伦膦酸钠可以改善去势大鼠股骨骨折骨痂的力学性质，增加骨痂骨密度。使用阿伦膦酸钠延缓了骨痂的骨重建过程，使编织骨向板层骨转换延缓。 3.1，25(OH)2D3可以改善骨痂的力学强度，增加骨痂骨密度，能够促进编织骨向板层骨转化，有利于骨折愈合。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语说明

声明

前言

第一部分不同浓度阿伦膦酸钠对大鼠骨髓基质干细胞分化影响的体外实验研究

前言

1.材料和方法

1.1主要设备仪器

1.2大鼠骨质疏松模型的建立

1.3骨髓基质干细胞的分离和培养

1.4流式细胞仪检测

1.5细胞分化和药品使用

1.6碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和定量分析

1.7油红O染色和镜下计数

1.8目的基因RT-PCR扩增

1.9 Western blot分析

1.10统计学分析

2.结果

2.1大鼠骨质疏松模型鉴定

2.2骨髓基质干细胞的镜下观察

2.3骨髓基质干细胞的鉴定

2.4 ALP染色和定量

2.5油红O染色和计数分析

2.6 Aln作用后骨髓基质干细胞的基因表达

2.7使用MAPK通路特异性抑制剂后BMSCs的基因表达

2.8 MAPK信号通路在Aln发挥作用过程中的影响

附图

讨论

结论

创新点

参考文献

第二部分围骨折期不同时间段使用阿伦膦酸钠对去势大鼠骨折愈合影响的实验研究

前言

1.材料和方法

1.1主要设备仪器

1.2动物分组

1.3药物剂量

1.4骨折模型建立

1.5 X线观察

1.6 Micro-CT三维重建和形态计量分析

1.7三点弯曲实验

1.8组织形态学观察

1.9统计学分析

2.结果

2.1实验动物一般状况

2.2骨折愈合的X线观察:定性分析

2.3 Micro-CT

2.4三点弯曲实验

2.5组织形态学分析

附图

讨论

结论

创新点

参考文献

第三部分 1，25(OH)2D3对去势大鼠骨质疏松性骨折愈合影响的实验研究

前言

1.材料和方法

1.1主要设备仪器

1.2药品使用

1.3骨质疏松模型建立和鉴定

1.4骨折模型建立

1.5实验设计

1.6 X线观察

1.7 Micro-CT

1.8三点弯曲实验

1.9组织形态学观察

1.10统计学分析

2.结果

2.1实验动物一般状况

2.2大鼠骨质疏松模型鉴定

2.3 X线观察

2.4 micro-CT分析

2.5三点弯曲实验

2.6组织形态学观察

附图

讨论

结论

创新点

参考文献

全文结论

致谢

攻读博士期间发表文章和学术交流

综述骨质疏松性骨折非手术治疗的研究进展