N-Myc down stream regulated gene1(NDRG1)在白血病细胞分化中的作用和机制研究

摘要

N-Myc下游调控基因1（1，NDRG1）是参与应激和生长调控的细胞内蛋白。在多种肿瘤细胞分化中发生上调，并有抑制转移作用。研究表明，在髓系白血病细胞U937经低氧处理后，NDRG1发生显著上调，并证明与低氧诱导因子-1a（HIF-1a）有关，另有报道显示，U937细胞在经过维甲酸（RA）、维生素D3、弗波酯（TPA）等分化诱导剂处理以后NDRG1都发生上调。但是，在其他白血病细胞分化过程中是否也发生NDRG1的上调，以及NDRG1蛋白的上调在分化过程中发挥何种作用尚未阐明。本文以髓系白血病U937细胞为研究对象，对NDRG1在分化中的作用进行了研究。主要内容如下： ⑴分化诱导剂全反式维甲酸（ATRA）、TPA、二甲基亚砜（DMSO）诱导U937和NB4细胞分化，同时伴有NDRG1蛋白水平的上调，其中，以ATRA处理两种细胞时NDRG1蛋白水平上调最为显著。U937细胞中，ATRA、TPA可以同时诱导ndrg1基因水平的上调，但DMSO处理的U937细胞中ndrg1基因却没有发生上调；在NB4细胞中，则是ATRA与DMSO可以诱导ndrg1 mRNA上调，TPA却没有明显作用。 ⑵为了了解NDRG1在分化过程中的作用，应用shRNA技术将U937细胞中的NDRG1进行敲除，观察对分化的影响。结果发现，当NDRG1蛋白被敲除后，各种分化指标的检测证实ATRA诱导的U937细胞分化进程明显受阻。具体表现为，细胞表面分化相关抗原CD11c的表达在浓度为10-7M的ATRA处理48h后，相对于对照组，表达被明显抑制，细胞形态也较对照组相对原始；另外，细胞终末分化的标志性基因ncf-1和orm-1在ndrg1 siRNA的细胞中也明显减少，这些都显示了敲除NDRG1的细胞较未敲除细胞表现得更加幼稚，即对药物诱导的分化反应能力下降。但是，单核方向分化诱导剂TPA 20nM诱导的分化却没有受到明显影响，具体表现为，CD11c的表达没有受到抑制，细胞形态仍然表现为单核细胞方向的分化。 ⑶在对NDRG1进行敲除以后，为排除可能存在的人为影响因素，从而构建了NDRG1诱导表达的细胞系，并进一步证明了NDRG1在细胞分化中扮演了至关重要的角色。实验证明，当NDRG1被诱导表达后，细胞表面分化相关抗原CD11c以及CD11b均发生了阳性表达，且细胞形态上也表现出明显的分化表型，且细胞形态上也表现出明显的分化表型，如胞浆与核质直径比值变小，核型呈肾形改变。 ⑷为了探明NDRG1通过何种途径发挥其对分化的影响，我们检测了在NDRG1敲除的细胞、NDRG1诱导表达细胞和对照组细胞中与髓系细胞分化过程密切相关的转录因子的水平。PU.1作为分化的重要转录因子在NDRG1敲除的细胞中受到了抑制；继而，对PU.1起主要调控作用的转录因子C/EBP beta也出现了抑制，但另一与分化密切相关的转录因子C/EBP alpha却没有受到影响，提示NDRG1可能位于C/EBP beta与PU.1的上游，并通过对这些转录因子的影响发挥其在分化过程中的作用。 ⑸本研究认为： ATRA通过NDRG1、C/EBP beta和PU.1通路，发挥诱导髓系白血病细胞分化的作用。这些实验结果不仅明确了NDRG1在细胞分化中起到关键性作用，而且初步探明其信号调控通路，为进一步认识ATRA诱导髓系白血病细胞分化机制和NDRG1作为药物靶标提供了新的线索。