DHA-1型质粒AmpC酶的研究

摘要

目的：本课题通过对DHA-1型质粒AmpC酶耐药性分析，流行病学调查和临床病例回顾来较为全面的了解DHA-1型质粒AmpC酶的耐药谱，传播特征及其菌株感染患者的临床特征，同时对DHA-1基因表达的调控基因ampR和ampD进行检测及克隆测序，并进一步研究重组子的表型特征。 方法： 1，收集产DHA-1型质粒AmpC酶的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌感染者的临床资料，比较不同病例组间的年龄，性别，基础疾病和抗生素前期应用情况等风险因素。 2，微量稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）；聚合酶链反应（PCR）扩增及测序确定DHA-1和超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的基因型。 3，随机扩增多态DNA（RAPD）调查产DHA-1型质粒AmpC酶的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的同源性。接合实验验证耐药基因的传递性。 4，质粒酶切图谱比对研究携带DHA-1基因质粒的播散情况。 5，Southern blot进行DHA-1基因的定位，同时确定其所在片段大小。 6，对DHA-1型质粒AmpC酶的ampR及ampD基因进行PCR扩增及测序，比对AmpR蛋白与摩根摩根菌的AmpR蛋白，将ampR基因和ampC基因同时克隆入pUC19载体，测定重组子的MIC。 结果：临床资料分组比对后发现，不同病例组间的年龄，性别和基础疾病等风险因素方面的差异无统计学意义。前期应用三代头孢菌素和喹诺酮类在仅产AmpC酶和同时合并产ESBL的组间比较时有显著性差异。多数产DHA-1型酶的细菌呈多重耐药，并有一株菌对碳青霉烯类药物耐药。RAPD和质粒酶切图谱分析表明DHA-1的流行是由克隆传播和质粒播散共同作用造成的。8株DHA-1型质粒AmpC酶菌株接合成功。Southern blot实验证明DHA-1编码基因位于质粒上，杂交片段为6-8KB。肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌中扩增测序的AmpR与其起源的摩根摩根菌的AmpR蛋白进行比对，发现在229位（L-Q）和273（A-T）出现氨基酸序列的改变。 结论：产DHA-1型质粒AmpC酶菌株感染者与CMY-2型感染者临床特征相似。仅产AmpC酶与同时合并产ESBL在前期应用抗生素方面有显著差。DHA-1型质粒AmpC酶的流行是由克隆传播和质粒播散共同作用造成的。对ampR基因与ampC基因克隆测序发现，相对于DHA-1型AmpC酶起源的摩根摩根菌而言，AmpR蛋白存在229位（L-Q）和273（A-T）的改变。