三七代谢表型变化及其主要影响因素以及人类粪便水相组分的代谢组学分析

摘要

代谢组学是对某一组织或细胞在一特定生理时期内所有低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析,通过考察生物体系(细胞、组织或生物体)受刺激或扰动后其代谢产物的变化或其随时间的变化而研究生物体系的一门科学。本文基于代谢组学策略和优化的仪器分析方法的基础上分别研究了以下内容:(1)基于UPLC/ESI-MS分析技术对药用植物三七的不同组织材料的代谢物表型变化及其主要影响因素进行研究;(2)基于氯甲酸乙酯衍生和GC/MS分析方法对肠道病人的粪便水相组分进行研究。主要研究内容和结果如下:
　　 1.基于UPLC/ESI-MS检测方法,对与三七不定根诱导相关的5种组织材料的代谢物表型变化及其主要影响因素进行研究。这5种材料分别是三七幼嫩花蕾、诱导自三七花蕾的愈伤组织、诱导自前述愈伤组织的不定根、茉莉酸甲酯刺激培养的不定根以及三七块根。在优化的UPLC/ESI-MS检测方法的基础上,对5种组织材料的70％甲醇提取物进行分析,并采用主成分分析的建模方法对质谱数据进行代谢轮廓分析。结果表明,它们之间的代谢物表型变化与细胞分化状态和环境压力胁迫之间具有相关性,而引起这种变化的主要差异性物质是皂苷。根据主成分分析和定量分析结果,进一步推断引起三七不同代谢物表型变化的主要因素是由激素(细胞生长素和细胞分裂素)控制的细胞分化状态,次要因素是环境胁迫因子如茉莉酸甲酯。该研究证明诱导自三七花蕾的不定根适合用于组织培养生产三七块根中含有的皂苷。在监测代谢物表型变化的基础上,可以通过调节影响代谢表型变化的主要和次要因素有目的地模拟出所需要的代谢物表型。
　　 2.为了对肠道疾病病人的粪便水相组分进行代谢组学研究,建立了一种基于氯甲酸乙酯衍生技术和GC/MS分析方法的粪便水相代谢物无偏向性检测方法,主要研究结果如下:
　　 (1)优化气相色谱条件,将初始柱温降低到40℃,并应用保留时间锁定技术控制保留时间的重复性;
　　 (2)详细研究影响氯甲酸烷基酯衍生效率的因素和规律,发现氯甲酸乙酯和乙醇试剂对的衍生产物具有合适的色谱保留时间和更好的灵敏度和分离度;探讨乙醇和水对衍生效率的影响,优化了乙醇、水和吡啶的用量和比例;对于粪便组分的全分析来说,两步衍生法优于一步衍生法;而初始反应体系中pH值对衍生效率具有重要影响,由低浓度碳酸氢钠提供的弱碱性环境获得更好的衍生产率。
　　 (3)应用多维统计分析方法研究粪便样品的储存和提取条件,发现冷冻储存的粪便水相组分中氨基酸的含量显著增加,而粪便的纯水提取物优于酸性和碱性水溶液提取物。
　　 (4)在优化并经验证的方法学基础上,对健康人和克劳恩病人的粪便样品进行分析,获得约180个代谢物,采用标准品对照、商业EI质谱数据库检索并结合CI质谱数据验证技术对粪便水相组分进行定性,共鉴定出约70个粪便代谢物。
　　 (5)应用主成分分析和偏最小二乘判别分析对经正交过滤的健康人和克劳恩病人粪便质谱数据进行分析,结合单维统计分析结果,共获得6个差异性代谢物。同时对34个代谢物进行定量分析,获得3个差异性代谢物,其中有两个代谢物与未定量的多维统计分析结果一致。