红松体细胞胚胎发生及超低温保存技术研究

摘要

本研究以红松(Pinus koraiensis sieb. Et zucc.)未成熟合子胚为外植体，诱导体细胞胚胎发生，研究了红松体细胞胚胎发生的各种影响因素、胚性愈伤组织在体细胞胚胎诱导过程中的生理生化特性以及愈伤组织的超低温保存，具体结果如下： 1、分别于7月5日、7月15日、7月25日采收红松未成熟合子胚，在添加2,4-D 1.0、2.0、4.0mg/L，6-BA 0.5、1.0、2.0mg/L GLH 诱导培养基上诱导愈伤组织。结果表明：未成熟合子胚的采样时间(发育程度)、2,4-D和6-BA的浓度极显著影响红松愈伤组织的诱导率。多重比较可知7月5日前后为红松未成熟合子胚的最佳采样时期，2,4-D 2.0mg/L＋6-BA1.0mg/L为诱导红松愈伤组织的最佳生长调节剂浓度组合，最高诱导率达43.33％。 2、红松胚性愈伤组织增殖阶段的生长曲线基本呈“S”形，继代20d后胚性愈伤组织增长趋于停滞。胚性愈伤组织生长率先快后慢，生长率最大值出现在继代后第12d 左右。研究结果表明了红松胚性愈伤组织增殖培养阶段适宜的继代频率为每2-3周继代一次。 3、分别在GLH 培养基上添加不同浓度的蔗糖、ABA、PEG 来诱导红松体细胞胚，结果表明不同浓度的蔗糖、ABA 对红松体细胞胚胎的诱导有极显著影响，GLH＋蔗糖60g/L＋ABA 20mg/L为诱导红松体细胞胚胎的最佳培养基，体细胞胚诱导数量达到47.5个/克愈伤组织，但PEG对红松体细胞胚的诱导并没有显著影响。诱导所得体细胞胚在萌发培养基(GLH＋蔗糖20g/L)上萌发率为73.3％。萌发后生成的体胚苗移栽成活率为64.3％。 4、成熟胚诱导阶段红松胚性愈伤组织内可溶性总糖与蔗糖含量变化趋势相似，两者都是0-5d 迅速上升，5-15d下降，15-25d再上升，之后保持平稳。可溶性蛋白质含量在0-10d升高，10-20d降低，20d后又上升并有分子量大小约为63.2和31.7KD两种特异蛋白出现，这些特异蛋白可能作为体细胞胚胎形成的调控因子或结构蛋白而起作用。糖分与蛋白含量在此阶段均出现先上升、后下降再上升的变化趋势，这这表明此阶段胚性愈伤组织内代谢旺盛，体细胞胚胎正在形成。 5、红松愈伤组织分别预处理0、12、24、36、48h后用6种不同的冷冻保护剂进行超低温保存，保存3d后用4种不同方法解冻，结果表明：利用0.4mol/L 山梨醇(Sorb)溶液将红松愈伤组织预处理24h，以5％DMSO＋Sorb 0.4mol/L为冷冻保护剂进行超低温保存，采用20℃流水冲洗解冻，细胞的存活率较高，经恢复培养存活率达64.4％，这一研究结果为红松愈伤组织中长期保存技术的研究奠定了基础。