胚胎胰腺移植治疗糖尿病的实验研究

摘要

胚胎胰腺组织移植具有组织来源广、免疫原性低及生长潜力大等优点，可为糖尿病的治愈提供一种新的解决方案。本文旨在研究小鼠早期胚胎胰腺组织分离技术的基础上，利用C57BL/6 小鼠进行同种同源胚胎胰腺组织移植，观察其对糖尿病治疗作用，并对适于胚胎胰腺移植的胚胎发生期进行初步研究。 目的：（1）研究小鼠胚胎胰腺组织的内分泌功能和发育过程；(2)研究小鼠胚胎胰腺移植治疗糖尿病的作用及确定适于移植治疗糖尿病的胚胎发生期。 方法：(1) HE 染色、免疫组织化学染色和免疫荧光染色方法鉴定分离的E14.5、E16.5 胚胎胰腺。体外葡萄糖刺激胚胎胰腺胰岛素分泌，ELISA 方法测定胰岛素水平。(2)建立小鼠糖尿病模型，随机分为移植组(TX组)和假手术组(SO组)。分离、移植E14.5、E16.5 胚胎胰腺。观察移植受体血糖和体重变化；受体血糖降至正常水平后(≤11.2mmol/L)，腹腔注射葡萄糖耐量实验、胰岛素耐量实验观察受体对高糖的耐受及胰岛素敏感性变化。获取胚胎胰腺移植物，观察受体血糖和体重变化。测量获取移植物的大小和重量；HE 染色、免疫组织化学染色和免疫荧光染色方法进行移植物组织学鉴定；葡萄糖刺激胚胎胰腺移植物胰岛素分泌，ELISA 方法测定胰岛素水平。 结果：（1）组织学染色方法确认获得组织是胚胎胰腺。ELISA方法测定结果示: E14.5胚胎胰腺胰岛素分泌量低；E16.5胚胎胰腺胰岛素水平高（3.3mmol/L糖和16.7mmol/L高糖刺激胰岛素分泌量分别为：1.6±1.4ng/ml和4.1±1.9ng/ml）；与E14.5胚胎胰腺比较，有显著性差异(P＜0.05)。（2）E14.5和E16.5胚胎胰腺组织移植后，受体体重均显著增加；E14.5TX组和E16.5TX组受体血糖降至正常水平所需要的时间分别为：39.3±20.8天和27.6±9.9天；两者比较，无显著性差异(P=0.14)。获取移植物后7天，受体血糖升至22.5±6.2 mmol/L，体重显著降低；与获取前血糖和体重相比，有显著性差异(P＜0.05)。SO组受体体重逐渐降低，血糖持续高于25mmol/L；获取移植物前后，受体体重和血糖与获取前比较，无显著性差异(P＞0.05)。IPGTT实验示E14.5、E16.5TX组受体对葡萄糖刺激反应曲线相一致，t=30分钟都达到血糖最高值(＞29.0mmol/L)，t=120分钟血糖降至正常水平；SO组t=30分钟也达到血糖最高值(32.8±0.4mmol/L)，然而血糖变化幅度较小(P＞0.05)。IPITT实验示E14.5和E16.5TX组受体对胰岛素刺激反应曲线相一致，t=30分钟血糖降至最低值，90分钟恢复至胰岛素刺激实验前血糖水平；而SO组延迟至60分钟降至最低值(17.6±11.6 mmol/L)。获取移植物，E14.5和E16.5胚胎胰腺移植物的大小和体重无显著统差异(P＞0.05)。E14.5及E16.5胚胎胰腺移植物免疫组织学染色显示，移植后胚胎胰腺组织中有胰岛形成，胰岛素和胰高血糖素表达强度显著强于移植前胚胎胰腺组织；胰岛周围有大量的脂肪空泡，无外分泌组织发育。ELISA结果显示胚胎胰腺移植物较移植前胚胎胰腺的胰岛素分泌量显著增加；E14.5、E16.5胚胎胰腺组织移植物的胰岛素分泌量无显著性差异(3.3mmol/L糖刺激：1.26±0.05 ng/ml vs 4.15±1.7ng/ml，P＞0.05；16.7mmol/L糖刺激：7.15±0.7ng/ml vs 7.46±3.0 ng/ml，P＞0.05)。 结论：(1)内分泌功能鉴定证实：E14.5 胚胎胰腺已有少量胰岛素表达，E16.5 胚胎胰腺已具较好的内分泌功能。(2) E14.5和E16.5 胚胎胰腺移植物均能分泌胰岛素并有效控制受体高血糖症状，恢复正常体重、血糖、糖耐量及胰岛素敏感性。移植的胚胎胰腺可经历生长、分化、发育过程，形成成熟的胰岛。E14.5 及E16.5 胚胎胰腺移植物的大小和重量无显著性差异。(3)现有研究认为E14.5 适于移植治疗糖尿病的胚胎胰腺发生期。