胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的诱导及糖尿病细胞移植治疗的实验研究

摘要

胚胎干细胞(ES)是一种来源于胚胎内细胞团的全能型干细胞，具有分化为各种组织细胞的潜能，在适宜的条件下可分化为人们需要的细胞用于某些疾病的治疗。 糖尿病是由于胰岛β-细胞破坏或胰岛素抵抗所致的胰岛素绝对或相对缺乏。补充胰岛素是Ⅰ型和部分Ⅱ型糖尿病的传统治疗手段。胰岛素治疗虽能控制症状、延缓和减少并发症的发生，但不能使糖尿病彻底治愈。利用ES细胞的全能分化特性，将ES细胞定向地诱导为胰岛素分泌细胞(IPC)用于糖尿病的治疗，有可能使糖尿病得到治愈。 多项研究表明，ES细胞可诱导分化为具有胰岛素分泌功能的IPC，这些细胞移植给糖尿病小鼠后有一定的治疗作用，这为糖尿病的细胞移植治疗带来了希望。但由ES细胞诱导生成的IPC数量少、功能较差、诱导时间长、诱导过程复杂，与临床运用的要求尚有一定差距。 胰腺十二指肠同源盒-1基因(pdx-1)是调节胰腺发育和胰岛β细胞分化的关键基因，也是维持正常胰岛β细胞生理功能不可缺少的基因。用pdx-1基因转染小鼠胚胎干细胞，使之高表达pdx-1，有可能增加ES细胞向胰岛素分泌细胞分化的转化率，提高其胰岛素的分泌功能。 为了缩短IPC的诱导周期，简化诱导方法，提高IPC的获得量和胰岛素分泌功能，我们构建了携带绿色荧光蛋白报告基因的pdx-1基因真核表达载体，将pdx-1转染小鼠胚胎干细胞后在转染细胞中获得了表达；经过对ES细胞培养扩增和ES细胞向IPC分化诱导的系统实验观察，我们改进了胰岛素分泌细胞的诱导方法，缩短了诱导时间；将胰岛素分泌细胞移植于糖尿病小鼠后，这些细胞能在小鼠体内存活增殖，并使血糖恢复正常。主要实验结果如下： 1、从孕小鼠分离胚胎成纤维细胞(MEF)，纯化后用于ES细胞饲养层的制备。发现胎龄13.5d的胚胎用于分离MEF效果最好，大于15d或小于11d的胚胎均不能得到数量足够、增殖能力旺盛的MEF；在进行丝裂霉素C(MMC)处理时，第2-4代MEF用10μg/ml浓度的MMC在37℃处理60min-90min为宜。 采用MEF饲养层和白血病抑制因子(LIF)相结合的方法培养ES细胞，可有效地防止ES细胞的分化。在MEF饲养层上，ES接种4d之内可以保持旺盛的增殖而不发生分化；连续培养4d之后，ES细胞出现不同程度分化，并逐步消失；进行无饲养层培养时，ES增殖缓慢并容易出现早期分化，难于在无饲养层培养条件下长期维持。 2、从小鼠胰腺组织提取总RNA后，用RT-PCR法扩增了876bp长度的小鼠pdx-1基因cDNA，经过电泳、回收、纯化后与携带绿色荧光蛋白报告基因的质粒载体pEGFP-N1重组成新的载体pEGFP/pdx-1，转化大肠杆菌DH5α后在细菌中扩增质粒。经过质粒抽提，酶切，电泳分析和DNA测序鉴定，876bp的pdx-1基因片段成功插入到载体中，插入方向正确。和GenBank数据库中的序列比对后确认无误，说明载体构建成功。转化菌扩增后抽提质粒，用脂质体转染法转染ES细胞，24h后可见转染细胞内有绿色荧光蛋白报告基因表达，但较弱；转染48h后，报告基因表达增强。经RT-PCR检测，发现转染细胞有pdx-1表达。转染的ES细胞转种于新的饲养层上进行G418抗性筛选，在含G418300μg/ml的ES培养基中，有少量ES集落存活并能够传代。转染4d后，报告基因不再继续表达，pdx-1的表达也消失。但ES细胞依然可以在含G418300μg/ml的ES培养基存活。 3、ES细胞在饲养层上扩增4d后消化为单细胞，在不含LIF的EB培养液中悬浮培养4d，形成胚胎体(EB)，收集EB进行贴壁培养。待EB贴壁后用无血清的神经前体细胞(NPC)选择性培养基进行NPC诱导。72h内，大量细胞死亡、脱落，剩余细胞分化为上皮样细胞或神经元样细胞。诱导第4d，大部分细胞呈神经细胞样形态，经nestin免疫组化染色鉴定，剩余的细胞大部分为nestin阳性细胞。诱导5d后，细胞数量减少，剩余细胞呈典型的神经元样形态。 经NPC培养基诱导4d的细胞更换为无血清的胰岛素分泌细胞(IPC)选择性培养基，进行IPC诱导。培养3d后，神经元样细胞减少，但从多突起的神经元样细胞的周边长出许多细小的圆形细胞。增加诱导培养基中的葡萄糖浓度后，圆形细胞逐步增多，体积增大，并聚集成团。诱导第5d出现双硫腙(DTZ)染色阳性细胞。诱导第6d，DTZ阳性细胞增多。作胰岛素免疫组化染色检查，聚集成团的细胞呈胰岛素染色阳性。由于IPC中的胰岛素和Zn2+结合形成结晶，贮存于β颗粒中。DTZ能和Zn2+结合，使含Zn2+的细胞显棕红色。因此，DTZ染色被认为是胰岛β细胞的特异性染色方法。在IPC培养基中诱导6d的细胞团具有胰岛β细胞的染体特征，经胰岛素免疫组化染色进一步证明这些细胞具有胰岛素合成功能。 与文献报道的28d-32d的IPC诱导时间相比，我们的诱导方案共用18d，诱导时间显著缩短。在此基础上，我们进一步改进了诱导方法，不经过NPC阶段的诱导，将扩增后的ES细胞直接进行IPC诱导。结果共经历14d诱导培养，也得到了与多阶段诱导结果类似的IPC，诱导时间进一步缩短。改良诱导法不仅缩短了时间，简化了诱导方法，也证明NPC阶段不是ES细胞向IPC分化的必经阶段。 4、为了进行胰岛素分泌细胞的移植治疗，我们采用链脲霉素(STZ)腹腔注射制备了糖尿病小鼠模型。实验发现，STZ用80mg/Kg分2次，间隔3d给药，比100mg/Kg一次给药制备的糖尿病模型更适合用于细胞移植治疗研究。经多次测定空腹血糖和体重，确认模型制备成功。选择血糖稳定于13mmol/L-25mmol/L的糖尿病小鼠为IPC移植治疗的观察对象。将IPC消化后用hochest33342标记后给糖尿病小鼠进行移植。每只小鼠移植1×106IPC于肝脏或皮下，用环孢素A预防移植排斥。结果肝脏内移植者移植一周后血糖下降，但未恢复正常。移植后12d取肝脏进行病理切片检查，未发现有标记的移植细胞。皮下移植者移植一周后血糖完全恢复正常。12d后取移植部位组织检查，发现有大量移植细胞存在。移植细胞大多数成团块状生长，和周围脂肪组织有明显界。也有的移植细胞散在分布于脂肪组织中。经胰岛素免疫组化检测发现，移植细胞呈胰岛素染色阳性。说明移植的IPC在受者体内存活增殖并分泌胰岛素，使糖尿病小鼠的血糖恢复正常。 虽然我们改进了IPC的诱导条件，缩短了IPC的诱导时间，将IPC用于糖尿病小鼠的实验治疗取得初步疗效；构建了pdx-1基因的表达载体，并在ES细胞内获得了短暂表达，为糖尿病的细胞移植治疗打下了一定的基础，但未能获得构成性表达pdx-1的ES细胞系，因而未能观察到外源性pdx-1过表达对ES细胞向IPC分化的影响，也未能进行IPC移植治疗的大批量、长时间观察，今后应继续这方面的工作，为糖尿病的细胞移植治疗积累更多的数据。

目录

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常用英文缩写一览表

前言

第一部分 小鼠胚胎干细胞的培养扩增及鉴定

第二部分 小鼠pdx-1基因表达载体的构建及其在小鼠胚胎干细胞中的表达

第三部分 小鼠胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的体外诱导

第四部分 胰岛素分泌细胞移植治疗糖尿病的实验研究

全文总结

参考文献

致谢

文献综述一胰腺的发育及其相关基因调控

文献综述二胰腺-十二指肠同源盒基因与胰岛功能调节

博士在读期间发表或参加会议交流的论文